呂青青,陳寒青

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

肝臟是一個重要的器官,在代謝系統(tǒng)中起著重要的作用。然而,肝臟也相對脆弱,易受到病毒、藥物、有毒化學物質(zhì)和酒精等多種外源性因素的破壞,如果損傷沒有得到緩解或消除,那么就會影響肝臟的代謝功能[1-2]。雖然已經(jīng)有藥物可以治療肝損傷,但它們都有許多副作用,如腹瀉、嘔吐、惡心和過敏等,從而限制了它們的應(yīng)用[3]。因此尋找能治療肝損傷而不會引起副作用的天然物質(zhì)被廣泛關(guān)注。

多糖是一種天然的大分子聚合物,具有多種生物活性[4-5],但是部分天然多糖的生物活性較弱,因此需要對天然多糖進行改性處理。硒是生物體必需的微量元素,適量攝入對機體健康有益。硒在某些抗氧化酶的合成中起著不可缺少的作用,同時硒還具有防止氧化應(yīng)激及保護生物膜的功能特性[6]。此外,有研究證實,硒的攝入可以提高抗氧化酶的活性,從而防止機體自由基的聚集[7]。但是無機硒具有一定的毒性,且不易被人體吸收,因此研究人員經(jīng)常通過化學改性或生物改性將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒。近年來,已證明硒多糖比原多糖具有更好的肝保護活性[8-9]。

小麥麩皮是小麥加工業(yè)的副產(chǎn)品,主要用作動物飼料,利用效率低,一定程度上造成了資源的浪費。小麥麩皮多糖是小麥麩皮的主要活性物質(zhì),具有抗氧化、抗癌和免疫增強等活性[10-12]。對于小麥麩皮多糖的研究目前主要集中在天然多糖和硫酸酯化多糖的生理活性,但對小麥麩皮硒化改性多糖的生理活性研究很少。

因此,本文采用超聲波輔助熱水提取和DEAE纖維素-52陰離子交換色譜成功獲得小麥麩皮多糖W2,利用化學改性方法制備硒化多糖SeW2-3,并研究這2種多糖對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料為小麥麩皮,由安徽鳳寶糧油食品有限公司提供;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯甲烷、正丁醇、無水碳酸鈉、亞硒酸鈉、抗壞血酸均為分析純。

普通生化試劑盒源自南京建成生物工程研究所;ELISA試劑盒源自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 小麥麩皮多糖的制備

將小麥麩皮用蒸餾水清洗6次,然后于45 ℃烘箱中干燥。將干燥后的小麥麩皮用中藥粉碎機進行粉碎,過40目篩后放置干燥處備用。稱取適量的小麥麩皮粉末于燒杯中,按照0.1 g/mL的比例添加體積分數(shù)95%的乙醇溶液,在室溫下攪拌2 h,用蒸餾水清洗至中性,以除去小分子的雜質(zhì)。將濾渣放置45 ℃烘箱中干燥后轉(zhuǎn)移至燒杯中,加入25倍體積的蒸餾水,然后室溫下用280 W超聲波處理1 h,隨后在60 ℃水浴中提取3 h,提取2次。將2次提取所得上清液合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至原來體積的1/4。向濃縮液中添加無水乙醇直至最終的乙醇體積分數(shù)為65%,然后置于4 ℃冰箱中過夜。將醇沉體系離心10 min后(3 500g),收集沉淀物復溶于蒸餾水中,采用Sevag法進行脫蛋白處理。重復此操作5、6次,直至無蛋白析出,將上清液用流水透析48 h (截留分子量為3 500 Da),冷凍干燥后得到小麥麩皮粗多糖。

稱取約100 mg粗多糖組分溶解在少量蒸餾水中,4 800g離心10 min后,取上清液注入DEAE 纖維素-52離子交換色譜柱(2.6 cm×40 cm)中,依次用蒸餾水、0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液進行洗脫,洗脫液的流速為5 mL/min,采用自動部分收集器收集洗脫液,每5 mL收集1管,采用苯酚硫酸法測定溶液在480 nm處的吸光度值,并繪制洗脫曲線。將0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到的主要組分收集,并用流水透析48 h,冷凍干燥后得到純化多糖,命名為W2。

1.3 硒化多糖的制備

根據(jù)已有研究,采用化學方法對W2進行硒化修飾[13]。準確稱取100 mg多糖溶于100 mLHNO3溶液(0.5%)中,向溶液中添加100 mg的亞硒酸鈉固體粉末,在70 ℃水浴條件下反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液冷卻并用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至5～6之間,離心后取上清液進行透析(截留分子量為3 500 Da),用抗壞血酸法每隔6 h檢測游離亞硒酸鈉,直到不再呈現(xiàn)紅色時結(jié)束透析,然后將透析液濃縮、冷凍干燥后得到硒化多糖SeW2-3。

1.4 體內(nèi)保肝活性

1.4.1 實驗動物

選擇清潔級ICR昆明雄性小鼠,72只,體質(zhì)量約20 g。所有動物飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境,飼喂正常飼料,保持12 h晝夜循環(huán)和自由攝食飲水,室內(nèi)保持通風良好,室溫控制在23 ℃左右,相對濕度為45%～65%。

1.4.2 實驗動物分組及處理

將72只正常小鼠隨機每8只小鼠分為1組,共9組。Ⅰ～Ⅱ組:正常對照組(NC)和模型對照組(MC),在正常飲食的基礎(chǔ)上每天灌胃一定體積生理鹽水;Ⅲ組:陽性對照組(PC),在正常飲食的基礎(chǔ)上每天灌胃200 mg/kg水飛薊素(溶于生理鹽水);Ⅳ～Ⅵ組:W2組,在正常飲食的基礎(chǔ)上每天分別灌胃50、100、200 mg/kg的W2(溶于生理鹽水);Ⅶ～Ⅸ組:Se-W2-3組,在正常飲食的基礎(chǔ)上每天分別灌胃50、100、200 mg/kg的Se-W2-3(溶于生理鹽水)。

第14天給藥后2 h,除正常組外,其余組均腹腔注射1%的CCl4大豆油復合物(5 mL/kg),正常組注射等量的大豆油,禁食不禁水。24 h后CO2窒息處死小鼠,立即將小鼠肝臟取出并稱其質(zhì)量,將一部分肝臟保存在10%福爾馬林溶液中,另一部分肝臟于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 測定指標及方法

血清中生化指標測定。CO2窒息處死小鼠后,立即吸取小鼠心臟血,置于離心管中,在4 ℃條件下離心10 min(2 500g),取血清備用。根據(jù)試劑盒說明書測定血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性。

嚴格按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)中的說明書測定小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平。首先,向包被細胞因子抗體的酶標板中加入待測樣品或標準品,溫育洗滌后加入酶標試劑,再次溫育洗滌后依次加入顯色劑A和顯色劑B,避光反應(yīng)后加入終止液,最后測定樣品的吸光度。

肝臟組織中抗氧化酶活性測定。取部分解凍的肝臟組織置于組織勻漿器中,按照每克肝臟加入9 mL冰生理鹽水反復研磨成勻漿,并在4 ℃條件下離心10 min(2 500g),取上清液備用。根據(jù)試劑盒說明書測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性。

肝臟組織中脂質(zhì)過氧化物水平測定根據(jù)試劑盒說明書測定丙二醛(MDA)的量。

半胱天冬酶(Caspases)活性測定。取20 mg解凍的肝臟組織置于小型組織勻漿器中,并加入100 μL裂解液,反復研磨成勻漿備用。嚴格按照Caspase-3和Caspase-8試劑盒的說明進行操作,測定其相對活性。

肝臟組織切片分析。取福爾馬林固定液中肝臟組織,采用不同體積分數(shù)的乙醇和二甲苯進行脫水處理和透明處理,用石蠟包埋后切成厚度為4～5 μm的肝臟組織切片。將切片用H&E染色,采用光學顯微鏡在200倍下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 19軟件中單因素方差分析(ANOVA)的Tukey法進行顯著性分析,n均為6(與正常組相比,*P<0.05、**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05、##P<0.01)。

2 結(jié)果與討論

2.1 血清中AST和ALT活性分析

血清中酶活性是衡量動物急性肝損傷的生化指標,如AST和ALT[14]。這些酶主要存在于各種細胞中,尤其在肝細胞中,因此在血液中的含量很小。但是,如果肝細胞因外部因素受到損傷,那么這些酶就會從肝組織滲入血液,從而導致血清中酶活性顯著升高[14]。近年來,一些報道也證實了大量的酶進入血流,會造成生物體組織進一步的損傷,如肝臟細胞浸潤等[15-16]。小鼠血清中AST和ALT活性如圖1所示。

圖1 小鼠血清中AST和ALT活性

從圖1可以看出,與NC組相比,MC組小鼠血清中的AST和ALT活性均顯著增加(P<0.01),表明CCl4誘導小鼠肝臟損傷;預(yù)先灌胃SeW2-3會顯著降低小鼠血清中AST(100、200 mg/kg)和ALT(50、200 mg/kg)活性,但預(yù)先灌胃W2并沒有顯著影響小鼠血清中AST和ALT活性。結(jié)果表明,預(yù)先灌胃SeW2-3比W2更能有效地降低小鼠血清中酶的活性,原因可能是硒在一定程度上具有抗氧化性,能有效地預(yù)防肝臟損傷,從而減緩AST和ALT從細胞釋放到血液中[8]。這一現(xiàn)象表明,SeW2-3比W2具有更強的保肝活性。

2.2 肝臟組織中抗氧化酶活性分析

在CYP450酶系的作用下,CCl4作為外源性肝毒素,會轉(zhuǎn)化為CCl3·和CCl3OO·2種自由基,從而產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)[17]。研究表明,ROS可引起生物體氧化應(yīng)激進而造成機體損傷[18]。生物體內(nèi)的抗氧化酶是應(yīng)對機體氧化應(yīng)激的第1道屏障,包括SOD、CAT和GSH-Px[19]。超氧陰離子在SOD作用下可以轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)[17],H2O2在GSH-Px或CAT的作用下可以分別轉(zhuǎn)化為無毒的羥基化合物或氧分子和水,從而降低機體的氧化損傷[20]。小鼠肝臟中SOD、CAT 和GSH-Px活性如圖2所示。

圖2 小鼠肝臟中SOD、CAT 和GSH-Px活性

從圖2可以看出,MC組小鼠肝臟中3種抗氧化酶的活性均顯著降低(P<0.01),這表明MC組小鼠肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激;但預(yù)先灌胃小鼠一定劑量的W2和SeW2-3都可以增強小鼠肝臟抗氧化酶活性,且呈現(xiàn)劑量依賴性。在相同劑量下,SeW2-3組小鼠肝臟中抗氧化酶的活性高于W2組,表明硒化改性增強了多糖的體內(nèi)抗氧化活性,進而減輕了CCl4對小鼠肝臟造成的損傷。

2.3 丙二醛的量分析

MDA作為脂質(zhì)過氧化的終端產(chǎn)物,其含量能夠反映機體氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的程度,從而判斷機體是否受到損傷[21]。小鼠肝臟中MDA的量如圖3所示,由圖3可知,與NC組相比,MC組小鼠肝臟中MDA的量顯著升高 (P<0.01),說明肝臟發(fā)生了脂質(zhì)過氧化,進一步證實了CCl4能成功誘導肝損傷;與MC組相比,預(yù)先灌胃W2不能顯著降低小鼠肝臟中MDA的量,但預(yù)先灌胃SeW2-3(200 mg/kg)能顯著降低小鼠肝臟中MDA的量(P<0.05)。以上結(jié)果表明,高劑量的SeW2-3能有效抑制小鼠肝臟中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

組別圖3 小鼠肝臟中MDA的量

2.4 血清中細胞因子水平分析

當機體受傷時,機體會產(chǎn)生炎癥細胞因子(如TNF-α和IL-1β)并釋放到血液中,用來抵御有害物質(zhì)的侵入[22]。研究表明,腹腔注射CCl4可刺激機體的免疫細胞或非免疫細胞釋放炎性細胞因子,而細胞因子的過度產(chǎn)生會加重炎癥反應(yīng),進而加重肝臟的損傷程度[9]。小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β水平如圖4所示。

圖4 小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β水平

由圖4可知,MC組小鼠血清中TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.01),表明MC組小鼠發(fā)生了炎癥反應(yīng)；W2組小鼠血清中細胞因子的水平變化不顯著，但SeW2-3預(yù)處理會顯著降低TNF-α和IL-1β水平,且呈劑量依賴性,表明硒化改性可以提高多糖對細胞因子釋放的抑制能力。

2.5 半胱天冬酶活性分析

Caspases是凋亡通路中的重要調(diào)控因子,包括Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9。Caspase-3和Caspase-8分別被認為是死亡受體介導的細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子和啟動子,而Caspase-9被認為是線粒體介導的凋亡通路的啟動子[23-24]。當機體受到刺激時,Caspase-9會被轉(zhuǎn)化為裂解的Caspase-9,后者可將Caspase-3轉(zhuǎn)化為裂解的Caspase-3[18],因此Caspase-3能從側(cè)面反映Caspase-9。小鼠肝臟中Caspase-3和Caspase-8相對活性如圖5所示。由圖5可知,MC組Caspase-3和Caspase-8活性較NC組顯著升高(P<0.01),表明Caspase參與了CCl4誘導的肝細胞的凋亡;經(jīng)W2和SeW2-3預(yù)處理后,均能降低肝臟中Caspase-3和Caspase-8的活性,且呈劑量依賴性;但是,在相同的劑量下,SeW2-3組Caspase-3和Caspase-8的相對活性比W2組低。

圖5 小鼠肝臟中Caspase-3和Caspase-8相對活性

表明硒化改性能提高多糖對Caspase-3和Caspase-8活性的抑制程度,從而緩解肝臟細胞凋亡,進而減輕小鼠的肝臟損傷。

2.6 肝臟組織病理切片分析

小鼠肝臟組織病理學切片如圖6所示,從圖6可以看出,NC組小鼠肝臟細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞排列相對有序,且細胞間界限清晰;與NC組相反,腹腔注射CCl4能致小鼠肝損傷,主要表現(xiàn)為細胞嚴重變性、肝細胞壞死、炎性浸潤,而水飛薊素預(yù)處理能有效保護肝臟免受CCl4的損傷;W2和SeW2-3預(yù)處理在一定程度上可以預(yù)防肝損傷,其特征是肝細胞壞死面積的減少。此外,從圖6還可以看出,經(jīng)SeW2-3預(yù)處理小鼠的肝細胞壞死面積比經(jīng)W2預(yù)處理小鼠的肝細胞壞死面積減少得更多,與血清生化指標、肝酶活性和半胱天冬酶活性的結(jié)果一致。從而進一步證實W2和SeW2-3都具有一定的肝保護活性,但是SeW2-3具有比W2更強的肝保護活性。

(a) Ⅰ組 (b) Ⅱ組 (c) Ⅲ組

3 結(jié) 論

體內(nèi)實驗結(jié)果表明,與W2相比,SeW2-3具有更好的肝保護活性,可以降低小鼠血清中AST、ALT及小鼠肝臟中Caspase-3、Caspase-8的活性,降低肝臟中MDA的量,增強肝臟組織中抗氧化酶活性及減少TNF-α和IL-1β的分泌水平。結(jié)果表明,硒化改性能顯著提高小麥麩皮多糖對小鼠急性肝損傷的保護活性,然而其更精確的分子機制還有待于深入研究。