何江波，石洋銖，康大偉，牛燕芬，王紀(jì)愛，陳 秀，秦 靜，畢曉旭，欒 杰，曹艷茹**

(1.昆明學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省疾病預(yù)防與控制中心，云南 昆明 650022)

白云鄂博稀土礦是一座世界罕見的多金屬共生礦床，礦產(chǎn)資源十分豐富，被譽(yù)為“世界稀土之鄉(xiāng)”[1]，其鈮?鐵礦床的稀土資源居世界第一[2].除此以外，該礦還含有豐富的銅礦、金礦等資源.白云鄂博稀土礦微生物是特殊的環(huán)境微生物，對這一特殊礦區(qū)的微生物資源進(jìn)行多樣性的研究，有利于我們研究其次生代謝產(chǎn)物的多樣性.特殊環(huán)境微生物具有獨(dú)特的新陳代謝途徑、適應(yīng)機(jī)制，因此會產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，可以為藥物的研發(fā)提供參考.放線菌Actinorectispora metalli是我們從白云鄂博礦區(qū)分離得到的一個(gè)放線菌新種[3]，前期研究表明該菌的典型菌株KC 198T在酵母膏?蛋白胨培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活性較好，分別在第7 d 和第8 d 時(shí)酶活性較高，其蛋白酶酶活性在28 ℃時(shí)達(dá)到最高.研究結(jié)果表明A.metalliKC 198T可作為工業(yè)酶制劑的菌株來源[4].因此，我們課題組繼續(xù)對A.metalliKC 198T進(jìn)行深入研究，挖掘高活性的次生代謝產(chǎn)物，為該菌的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 自白云鄂博稀土礦中分離，16S rRNA 基因序列分析結(jié)果表明KC 198 與印度放線菌(Actinorectispora indicaYIM 75 728)相似性最高，為98.4%.經(jīng)多相分類實(shí)驗(yàn)，命名為Actinorectispora metallisp.nov[3]，菌種目前保存于昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院菌種庫(編號為KC 198).

1.1.2 培養(yǎng)基 ISP2 培養(yǎng)基(1 L)：酵母膏4 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖4 g，動(dòng)物蛋白胨2 g，植物蛋白胨1 g，微量鹽1 mL，復(fù)合維生素少許，自來水1 000 mL，pH 7.2.

PDB 培養(yǎng)基(1 L)：土豆200 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，微量鹽1 mL.

1.1.3 主要試劑和儀器 1.1-二苯基-2-苦肼基自由基(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；柱層析用硅膠(0.054～0.077 mm)、薄層層析用硅膠GF254 均為青島海洋化工廠生產(chǎn)，Sephadex LH-20 (25～100 μm)為Pharmacia 公司產(chǎn)品；RP-18 (40～60 μm)為日本Daiso 產(chǎn)品.色譜試劑：甲醇、乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?.顯色劑為H2SO4(10%)的乙醇溶液.分析純甲醇超高壓液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀器(英國Waters 公司，Xevo TQ-S)；Avance 600 MHz 核磁共振儀(TMS 作為內(nèi)標(biāo))；島津UV-2401 紫外分光光度計(jì)；Hanbon-NP7000C 制備液相(漢邦儀器公司)，制備柱(Zorbax XDB-C-18，φ21.2×150 mm，5 μm)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化，N-1100)；搖床(上海智城分析儀器制造有限公司，ZWY-2102)；萬分之一電子天平(上海越平電子天平，F(xiàn)A1004B).

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與種子液的培養(yǎng) 將保存于?20 ℃的菌株接種于PDA 平板，28 ℃，7 d，以進(jìn)行活化.然后將單菌落接種至改良ISP2 培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床28 ℃，180 r/min，3 d，作為種子液.

1.2.2 菌株發(fā)酵 將種子液接種至PDB 培養(yǎng)基(121 ℃，滅 菌30 min，pH 7.2)，培 養(yǎng)8 d，28 ℃，180 r/min，發(fā)酵液采用紗布過濾，收集濾液，得發(fā)酵液25 L，然后將發(fā)酵液濃縮至2 L.

1.2.3 提取與分離 浸膏采用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，濃縮萃取液，得乙酸乙酯浸膏3.5 g.水層再次采用等體積正丁醇萃取3 次，濃縮萃取液，得正丁醇浸膏12.5 g.乙酸乙酯浸膏采用甲醇溶解后，過濾，除去不溶物，經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜初步分離，根據(jù)薄層色譜(TLC)，10%濃硫酸乙醇溶液顯色合并相似成分，得3 個(gè)組分Fr A～C.Fr A 組 分(238.3 mg)采用硅膠柱色譜(0.054～0.077 mm，φ2 cm×50 cm)再次純化，以石油醚?丙酮系統(tǒng)梯度洗脫(體積比10∶1～0∶1)，根據(jù)TLC合并相似組分，再經(jīng)Sephadex LH-20 柱(MeOH)分離后得到化合物1(4.3 mg).Fr C 經(jīng)RP-18 反相柱色譜(甲醇?水10%～100%，梯度洗脫，每梯度200 mL)分離，經(jīng)TLC (GF254硅膠板)檢測后為樣品Fr C1(162.2 mg)，采用制備液相進(jìn)一步分離，40%色譜甲醇等度洗脫(流速10 mL/min，tR12′33′′)，得化合物2(7.8 mg).Fr C2 質(zhì)量18.9 mg，采用制備液相分離純化，以10%色譜甲醇等梯度洗脫(流速10 mL/min，tR10′57′′)得化合物3(9.5 mg).正丁醇浸膏采用甲醇溶解，過濾，棄去不溶物，采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜脫糖，得到Fr A-F 部分.Fr A 部分采用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚?丙酮體系(體積比10∶1～0∶1，梯度洗脫)，得到FrA1-3，F(xiàn)rA-1 再次采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化得到化合物4(11 mg).FrA-2 采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化得到化合物5(8.2 mg).Fr C 1.2 g，采用RP-18 (10%～100%，梯度洗脫，每個(gè)梯度200 mL)，根據(jù)TLC 顯色合并相似部分，然后采用硅膠柱色譜法石油醚?丙酮梯度洗脫(體積比5∶1～0∶1)，得化合物6(25.8 mg).Fr D 部分采用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜脫色，根據(jù)TLC 合并相似組分，然后采用制備液相70%甲醇水等度洗脫純化(流速10 mL/min，tR14′00′′)，得化合物7(9.0 mg).以上化合物結(jié)構(gòu)見圖1.

圖1 化合物1～7 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of compounds 1?7

1.2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn) 稱取一定量的DPPH粉末，用甲醇溶解，配成1 mmol/L 的母液.測定時(shí)用甲醇稀釋10 倍，配成0.1 mmol/L 的DPPH 反應(yīng)液.取用甲醇稀釋的不同濃度樣品0.5 mL 于5 mL離心管中，加入2 mL 的DPPH 工作液，混勻，振蕩30 min，在517 nm 處測定吸光值.然后按照公式計(jì)算DPPH 自由基清除率，并計(jì)算IC50值.

其中：A0—對照組吸光值，0.5 mL 甲醇+2 mL DPPH；Ax0—0.5 mL 樣品+2 mL 甲醇；Ax—0.5 mL 樣品+2 mL DPPH.

2 結(jié)果與分析

2.1 新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，無色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MS：m/z365 [M-H]?；HR-ESI-MS：m/z401.100 7，[M+Cl]?，calcd.for根據(jù)1H NMR 和13C NMR 推測該化合物為含有萘環(huán)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)還含有一個(gè)β型(δ=5.04，J=6.0 Hz)葡萄糖的單元.根據(jù)質(zhì)譜推斷該化合物含有18 個(gè)碳，其中包含一個(gè)萘環(huán)單元，一個(gè)葡萄糖單元，以及兩個(gè)甲氧基.再次結(jié)合1H NMR 分析，萘環(huán)上有5 個(gè)未取代的H 信號，兩個(gè)甲氧基信號在δ=3.96 (3H，s，1-OCH3)和3.99 (3H，s，4-OCH3).根據(jù)1H-1H COSY譜可知，δH=8.11 與δH=7.35 相 關(guān)，δH=7.35 與δ=7.49 相關(guān)，δH=7.49 與δH=8.00 相關(guān).因此推斷δC=123.1 與δC=125.0 連接，δC=125.0 與δC=127.9 連接，δC=127.9 與δC=122.1 連接(圖2).根據(jù)HMBC 圖譜，確定δH=3.96 與δC=138.2 連接，δH=3.99 與δC=153.8連接.δH=5.04 與δC=147.5 存在相關(guān)，確定糖單元的連接位置(圖2).

圖2 化合物1 的重要1H?1H COSY(─)和HMBC(→)相關(guān)Fig.2 The key 1H?1H COSY(─) and HMBC(→) correlations of compound 1

因此化合物1的結(jié)構(gòu)被確定，并命名為1,4-dimethoxy-2-hydroxy naphthalene-2-O-β-D-glucopyra noside，該化合物為新化合物，與文獻(xiàn)化合物1,2,4-trihydroxynaphthalene-2-O-β-D-glucopyranoside [5]相似.核磁數(shù)據(jù)為1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ：8.11(1H，dt，J=6.0，0.8 Hz，H-5)，8.00 (1H，dt，J=6.0，0.6 Hz，H-8)，7.49 (1H，ddd，J=6.0，5.0，0.8 Hz，H-7)，7.35 (1H，ddd，J=6.0，5.0，0.8 Hz，H-6)，6.99 (1H，s，H-3)，5.04 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，3.99 (3H，s，4-OCH3)，3.96 (3H，s，1-OCH3)，3.91 (1H，dd，J=9.0，1.8 Hz，H-6′b)，3.68 (1H，dd，J=9.0，4.8 Hz，H-6′a)，3.56 (1H，dd，J=7.2，6.0 Hz，H-2′)，3.50 (1H，t，J=6.6 Hz，H-3′)，3.46 (1H，ddd，J=7.2，4.8，1.8 Hz，H-5′)，3.38 (1H，dd，J=7.2，6.6 Hz，H-4′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：138.2 (C-1)，147.5 (C-2)，99.2(C-3)，153.8 (C-4)，123.1 (C-5)，125.0 (C-6)，127.9 (C-7)，122.1 (C-8)，130.3 (C-9)，123.8 (C-10)，103.7 (C-1′)，75.2 (C-2′)，78.2 (C-3′)，71.6 (C-4′)，78.5 (C-5′)，62.7 (C-6′)，62.2 (1-OCH3)，56.3 (4-OCH3).

2.2 已知化合物的核磁數(shù)據(jù)

化合物2：無色油狀物，易溶于甲醇.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.93 (1H，d，J=7.2 Hz，H-8)，7.65～7.62 (2H，m，H-5，H-6)，7.42 (1H，m，H-7)，4.92 (1H，dd，J=6.0，3.0 Hz，H-4)，2.86 (1H，ddd，J=13.2，5.4，3.6 Hz，H-2a)，2.62 (1H，ddd，J=13.2，7.8，3.6 Hz，H-2b)，2.36 (1H，m，H-3a)，2.11 (1H，m，H-3b).13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：200.2 (C-1)，36.4 (C-2)，33.1 (C-3)，68.4 (C-4)，127.8 (C-5)，135.4(C-6)，128.7 (C-7)，128.8 (C-8)，129.2 (C-9)，148.1 (C-10).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)化合物[6]一致，故鑒定為4-hydroxy-tetralone.

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.49 (1H，d，J=6.0 Hz，H-8′)，7.35 (1H，d，J=6.0 Hz，H-5′)，7.09 (1H，t，J=6.0 Hz，H-6′)，7.04 (1H，s，H-2′)，7.01 (1H，t，J=6.0 Hz，H-7′)，4.19 (1H，t，J=3.6 Hz，H-9)，3.46 (1H，dd，J=10.8，2.4 Hz，H-6)，3.40 (1H，dt，J=12.0，6.0 Hz，H-3)，3.10 (1H，dd，J=11.4，3.6 Hz，H-10)，2.99 (1H，ddd，J=9.0，7.2，1.8 Hz，H-3)，2.20 (1H，dd，J=8.4，4.8 Hz，H-10)，1.85 (1H，m，H-5)，1.75 (1H，m，H-4)，1.52 (1H，m，H-5)，1.20 (1H，m，H-4)；13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：166.8 (C-1)，44.6 (C-3)，20.9 (C-4)，29.8 (C-5)，58.1 (C-6)，170.2 (C-7)，57.8 (C-9)，28.3(C-10)，107.9 (C-1′)，124.8 (C-2′)，136.6 (C-4′)，111.0 (C-5′)，121.3 (C-6′)，118.1 (C-7′)，118.6 (C-8′)，127.2 (C-9′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)化合物[7]一致，故鑒定為環(huán)(L－色氨酸－L－脯氨酸).

化合物4：白色粉末，易溶于DMSO.1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.94 (1H，s，NH)，7.39 (1H，d，J=7.5 Hz，H-6)，5.45 (1H，d，J=7.5 Hz，H-5)；13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：151.6 (C-2)，164.4 (C-4)，142.3 (C-5)，100.3 (C-6).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)化合物[8]一致，故鑒定為尿嘧啶.

化合物5：13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：151.5 (C-2)，165.0 (C-4)，107.7 (C-5)，137.8 (C-6)，11.8 (CH3-5).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)化合物[9]一致，故鑒定為胸腺嘧啶.

化合物6：白色粉末，易溶于DMSO.1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.34 (1H，s，H-8)，8.13 (1H，s，H-2)，7.34 (2H，s，NH2)，5.87 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，5.48 (1H，d，J=6.0 Hz，OH-2′)，5.42 (1H，dd，J=7.2，4.8 Hz，OH-5′)，5.22 (1H，d，J=4.8 Hz，OH-3′)，4.60 (1H，d，J=6.0 Hz，H-2′)，4.14 (1H，dd，J=7.8，3.6 Hz，H-3′)，3.96 (1H，q，J=3.0 Hz，H-4′)，3.66 (1H，dt，J=12.0，3.6 Hz，H-5′)，3.55 (1H，ddd，J=11.4，6.6，3.6 Hz，H-5′)；13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：152.4 (C-2)，149.1 (C-4)，119.4 (C-5)，156.2 (C-6)，139.9 (C-8)，87.9 (C-1′)，73.5 (C-2′)，70.7 (C-3′)85.9 (C-4′)，61.7 (C-5′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)化合物[10]一致，故鑒定為β-adenosine.

化合物7：無色油狀物，易溶于甲醇.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.56 (1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，7.32 (1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.09 (1H，s，H-2)，7.07(1H，t，J=7.8 Hz，H-7)，6.99 (1H，t，J=7.8 Hz，H-5)，3.94 (1H，m，H-11)，3.55 (1H，dd，J=10.8，3.6 Hz，H-12a)，3.48 (1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-12b)，2.96 (1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-10a)，2.85 (1H，1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-10b);13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：124.3 (C-2)，112.6 (C-3)，119.7 (C-4)，119.6 (C-5)，122.4 (C-6)，112.3 (C-7)，138.3 (C-8)，129.2 (C-9)，30.7 (C-10) 74.0 (C-11)，67.0 (C-12).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)化合物[11]一致，故鑒定為3-(2,3-dihydroxypropyl)indole.

2.3 抗DPPH 自由基結(jié)果實(shí)驗(yàn)采用DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)評價(jià)化合物1～7的抗氧化能力.單體化合物分別配成50、40、30、20 μmol/L 的溶液.分別添加50 μL 到96 孔板，再加入200 μL DPPH 液體.在暗處放置30 min，再用酶標(biāo)儀于517 nm 處測定吸光度，并計(jì)算清除率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1～7均未顯示出DPPH 自由基清除活性.

3 討論與結(jié)論

微生物次生代謝產(chǎn)物是藥物的重要先導(dǎo)化合物來源，鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物被廣泛用作臨床藥物.從常規(guī)微生物資源中尋找藥物先導(dǎo)化合物面臨巨大的調(diào)整，因此我們選擇白云鄂博稀土礦中的微生物資源 進(jìn)行挖 掘.通過對A.metalliKC 198T進(jìn)行PDB 液體發(fā)酵產(chǎn)物研究，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)化合物，其中化合物1為新化合物，且化合物1的類似物1,2,4-trihydroxynaphthalene-2-O-β-D-glucopyranosides 具有抗氧化活性和拮抗Aβ42 疏水肽聚集活性，被認(rèn)為可以作為治療阿爾治海默癥的先導(dǎo)物[5].但是本次研究中未發(fā)現(xiàn)化合物1具有顯著的抗氧化活性，初步推斷其原因是酚羥基被甲基化后活性消失.另外，β-adenosine 也在本項(xiàng)研究中分離得到，該化合物在Domondon DL[10]的報(bào)道中，具有促進(jìn)蘑菇生長的作用.從A.metalliKC 198T良好的產(chǎn)酶活性，到次生代謝產(chǎn)物研究，均表明該菌具有較高的研究價(jià)值.

本研究對白云鄂博稀土礦放線菌A.metalliKC 198T的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步的研究，運(yùn)用現(xiàn)代分離分析方法共分離并鑒定了7 個(gè)化合物成分，其中化合物1為新化合物，其余化合物為已知化合物.通過抗氧化活性測試表明，所分離得到的化合物均無顯著的抗氧化活性.以上研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘白云鄂博稀土礦微生物資源奠定了物質(zhì)研究基礎(chǔ)，同時(shí)也豐富了鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物.