王 萌，趙 虎，趙曾菁，孟生德，吳 星，王日升*

(1 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，南寧 530007；2 甘肅省敦煌種業(yè)集團(tuán)股份有限公司，甘肅酒泉 735099)

葉色變異呈現(xiàn)金心、銀邊、網(wǎng)紋、彩葉、斑葉等特征是常見的突變性狀之一，這些植物多用于園林綠化和庭院美化，還可用于光合作用、光形態(tài)建成、葉色表達(dá)、遺傳轉(zhuǎn)化和農(nóng)作物種子雜種純度鑒定等科學(xué)研究，具有重要經(jīng)濟(jì)價值和科學(xué)價值。國內(nèi)外研究認(rèn)為葉片結(jié)構(gòu)變化、葉綠素、類胡蘿卜素、花色素苷的含量、比值以及在葉片中的分布均可造成葉色變異，葉色突變體的葉綠體發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量常發(fā)生變化進(jìn)而影響葉片的光合作用[1]。杜文文等[2]研究了古林箐秋海棠葉斑結(jié)構(gòu)對葉色的影響，發(fā)現(xiàn)斑區(qū)葉綠素含量比非斑區(qū)略低，斑區(qū)上表皮與柵欄組織細(xì)胞間的空隙是造成該區(qū)域相對周圍正常葉片區(qū)域偏白的原因。邱東萍等[3]研究了羽衣甘藍(lán)、花葉扶桑、紅花檵木等 8種園林彩葉植物的葉片結(jié)構(gòu)及其顯色部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯色部位不同是造成8種彩葉植物葉色各異的原因。戴斌等[4]研究表明，辣椒紫色葉片中的色素主要為花色素苷，且至少有兩種不同成分，花色素苷在葉片中主要存在于柵欄組織中是造成葉片正反面異色的原因。楊莎等[5]研究辣椒黃化突變體、鐘淮欽等[6]研究3種雜交蘭葉藝性狀中均發(fā)現(xiàn)，葉片中葉綠素、類胡蘿卜素含量顯著降低。辣椒葉色比較豐富，前人研究了黃化葉[5]、紫色葉[4]的遺傳及生理特性、色素含量、分布等，但辣椒彩色斑葉突變體或彩色花葉突變體(非感染花葉病毒)的相關(guān)研究尚未見報道。

基于彩色斑葉辣椒突變體葉片呈現(xiàn)彩色斑駁這一現(xiàn)象，本研究以正常紫葉辣椒(圖1，A)、白色斑葉辣椒突變體(圖1，B)為對照材料，進(jìn)行彩色斑葉辣椒突變體顯微結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)觀察，研究葉斑、花色素苷在葉片的分布、細(xì)胞器的數(shù)量與結(jié)構(gòu)變化特征，擬在細(xì)胞水平上解釋彩色斑葉辣椒復(fù)雜葉色的成因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所使用的彩色斑葉辣椒突變體為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所徐小萬研究員惠贈，因彩色斑葉辣椒突變體具有紫色和白色的斑塊(圖1，C)，斑塊的部位和顏色深度在群體內(nèi)甚至同一植株不同的枝條上都呈現(xiàn)著色不均勻現(xiàn)象(圖1，C)。為揭示彩色斑葉辣椒突變體彩色葉斑的成因，本研究以課題組保存且遺傳穩(wěn)定的紫葉辣椒、白色斑葉辣椒突變體為對照試材(圖1)開展研究，紫葉辣椒為資源收集獲得的葉片呈紫黑色的一份非突變型的辣椒材料(圖1，A)；白色斑葉辣椒是田間獲得的一份自然突變體材料，該突變體葉色呈現(xiàn)白綠斑駁(圖1，B)，因白斑特征與彩色斑葉辣椒斑塊(圖1，C)特征近似，所以也被選為對照材料。3份試材均種植于本單位的里建科研基地內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片顯色特征觀察從子葉期開始觀察葉片顯色時期、顯色部位、顯色特征以及斑塊發(fā)生時期、位置、大小等特征。

1.2.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察采摘3種辣椒功能葉，采用雙刀法制作徒手切片，觀察葉片不同顯色部位的葉肉細(xì)胞及結(jié)構(gòu)；用鑷子分別撕取葉片上下表皮制作臨時切片，觀察葉片不同斑區(qū)的表皮細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等，并拍照。

A.紫葉辣椒；B.白色斑葉辣椒突變體；C.彩色斑葉辣椒突變體；D. 著色不均的彩色斑葉辣椒突變體圖1 試驗材料A. Purple leaf pepper; B. Pepper mutant with white spot leaf; C. Pepper mutant with color spot leaf; D. Pepper mutant with color spot leaf of uneven coloringFig.1 Test materials

1.2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察采摘白色斑葉辣椒突變體和彩色斑葉辣椒突變體功能葉，在紫葉辣椒葉脈兩側(cè)、白色斑葉辣椒綠斑區(qū)以及彩色斑葉辣椒白斑區(qū)、綠斑區(qū)、紫斑區(qū)用刀片分別取樣，樣品尺寸約1 mm×1 mm，迅速投入2.5%戊二醛固定，真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h，4 ℃保存。透射電鏡超薄切片制作參考王振興[7]，包埋調(diào)整為使用 812包埋劑包埋，染色調(diào)整為2%醋酸鈾飽和酒精溶液和枸櫞酸鉛雙染色，各染色15 min，使用HT7700透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片顯色特征

田間觀察可以得知，彩色斑葉辣椒突變體子葉為紫黑色，自第一片真葉展開后，開始出現(xiàn)異色斑塊，斑塊隨著葉片生長逐漸擴大，在幼苗期、始花期、盛果期等不同時期葉片顏色顯色穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)“返綠”現(xiàn)象。通過田間觀察對比3種試驗材料的顯色特征(表1)發(fā)現(xiàn)，紫葉辣椒新葉為綠色，隨著葉片生長，花色素苷快速在葉片上表皮積累，從而導(dǎo)致葉片呈現(xiàn)紫黑色(圖1，A)；辣椒白色斑葉突變體自真葉期葉片開始顯現(xiàn)葉斑，葉斑呈白色、乳白色，葉斑延伸至葉片綠色部分則呈現(xiàn)淺綠色(圖1，B)；辣椒彩色斑葉突變體自真葉期葉片開始顯現(xiàn)葉斑，葉斑呈白色、乳白色、紫色、淺紫色，白斑延伸至葉片綠色部分則呈現(xiàn)淺綠色，紫斑延伸至葉片綠色部分則呈現(xiàn)紫黑色，紫色斑塊和白色斑塊的形狀不規(guī)則，斑區(qū)界限不清晰、色彩往往混雜在一起(圖1，C)。

表1 3種辣椒材料的葉片顯色特征對比

觀察彩色斑葉辣椒葉片斑塊顯現(xiàn)位置特征發(fā)現(xiàn)不同植株或同一植株不同枝條、不同葉片，葉斑的大小頻率、色彩深度無明顯規(guī)律(圖1，D)。白色斑葉突變體田間觀察也發(fā)現(xiàn)不同時期葉片顯色和斑塊特征有類似現(xiàn)象，區(qū)別是沒有紫色斑塊。通過與紫葉辣椒和白色斑葉辣椒葉片顯色特征比對，分析得出辣椒彩色斑葉突變體葉片的基本色是紫色，突變導(dǎo)致了花色素苷分布不均，同時該突變體也發(fā)生了與白色斑葉突變體相同的白斑突變，白斑位置隨機出現(xiàn)和紫色深淺不同均受環(huán)境影響。下述彩色斑葉辣椒的斑區(qū)以主要色彩進(jìn)行區(qū)分。

2.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察

從顯微觀察結(jié)果對比(表2)和圖2看出，彩色斑葉辣椒突變體葉片完全失綠的白色斑區(qū)葉肉細(xì)胞大部分呈現(xiàn)白色，柵欄組織和海綿組織難區(qū)分(圖2，A1)，表明葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體大量缺失；如果該區(qū)域積累了大量的花色素苷，則細(xì)胞紫紅色、近球形(圖2，A2)；綠色為主的部位柵欄組織和海綿組織較易區(qū)分，大部分葉肉細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，可觀察到部分柵欄組織、海綿組織呈現(xiàn)紫紅色，(圖2，A3)。紫葉辣椒葉片徒手切片通常可以觀察到紫色的葉肉細(xì)胞分布在葉片橫切面的一側(cè)，不易看清柵欄組織和海綿組織(圖3，A1)，切片非常薄時才可以清晰地觀察到柵欄組織，確定紫紅色的葉肉細(xì)胞屬于柵欄組織(圖3，A2)，此外，紫葉辣椒葉片正面紫色，背面為綠色也可以驗證該觀察結(jié)果。紫葉辣椒顯色部位顯微觀察結(jié)果與彩色斑葉辣椒紫色斑區(qū)觀察結(jié)果不一致。白色斑葉辣椒葉肉細(xì)胞為綠色，白色斑區(qū)大部分葉肉細(xì)胞則呈現(xiàn)白色(圖4，A)，與彩色斑葉辣椒白色斑區(qū)一致。

A. 彩色斑葉辣椒葉片橫切面(10×10)：A1. 白色斑區(qū)； A2.紫色斑區(qū)；A3. 綠色斑區(qū)；B. 彩色斑葉辣椒葉片上表皮細(xì)胞(100×10)：B1.綠色斑區(qū)；B2.紫色斑區(qū)；B3.白色斑區(qū)圖2 彩色斑葉辣椒突變體葉片顯微觀察A. Cross sections of pepper mutant with color spot leaf (10×10): A1. White spot area； A2. Purple spot area； A3. Green spot area； B. Leaf upper epidermal cells of pepper mutant with color spot leaf (100×10): B1. Green spot area； B2. Purple spot area； B3. White spot areaFig.2 Microscopic observation on leaves of pepper mutant with color spot leaf

A.紫葉辣椒葉片橫切面(10×10)：A1.橫切面； A2.清晰的柵欄組織；B.紫葉辣椒表皮細(xì)胞(100×10)：B1.上表皮； B2.下表皮圖3 紫葉辣椒葉片顯微觀察A. Cross sections of purple leaves pepper (10×10): A1. Cross section； A2. Clear palisade cell； B. Leaf epidermal cells of purple leaves pepper (100×10): B1. Upper epidermis； B2. Lower epidermisFig.3 Microscopic observation on leaves of purple leaf pepper

A.白色部位橫切(10×10)；B.上表皮細(xì)胞(100×10)；C.下表皮細(xì)胞(100×10)圖4 白色斑葉辣椒突變體葉片顯微觀察A. Cross section of white spot area(10×10)；B. Upper epidermis(100×10)； C. Lower epidermis(100×10)Fig.4 Microscopic observation on leaves of pepper mutant with white spot leaf

表2 3種辣椒材料顯微觀察結(jié)果對比

彩色斑葉辣椒綠色斑區(qū)葉片上下表皮上有少量氣孔保衛(wèi)細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色(圖2，B1)，紫色斑區(qū)上下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色的數(shù)量更多(圖2，B2)，白色斑區(qū)上下表皮也有少量保衛(wèi)細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色，上下表皮細(xì)胞完全呈現(xiàn)白色，沒有花色素苷分布的情況較少(圖2，B3)。紫色辣椒葉片上下表皮上也有較多的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色，上表皮觀察時往往可以看到紫紅色的葉肉細(xì)胞(圖3，B1)，下表皮則沒有紫色的葉肉細(xì)胞(圖3，B2)。白色斑葉辣椒葉片上表皮偶有觀察到極少量呈現(xiàn)紫紅色的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞(圖4，B)，通常上表皮和下表皮一樣，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞沒有紫紅色(圖4，C)。葉色突變種類較多，根據(jù)葉色表型可分為白化、條紋、黃化、淡黃綠、淡綠、常綠、斑葉、紫葉、白黃和白綠等類型。Hara[8]將葉斑產(chǎn)生原因分為2類4種，即色素型(包括葉綠素型和色素型)和結(jié)構(gòu)型(包括表皮型和空隙型)。據(jù)此，本研究彩色斑葉辣椒突變體試材同時具有花色素苷分布不均，也有葉綠素缺失，葉斑類型屬于色素型。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

白色斑葉辣椒綠斑區(qū)、紫葉辣椒中部葉脈兩側(cè)以及彩色斑葉辣椒白斑區(qū)、綠斑區(qū)、紫斑區(qū)的超微結(jié)構(gòu)顯示，白色斑葉辣椒綠斑區(qū)葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)最好，未見明顯水腫(圖版Ⅰ，1)，葉綠體等細(xì)胞器也未見明顯異常(圖版Ⅰ，2)。紫葉辣椒葉片細(xì)胞呈輕度水腫，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器輕度腫脹(圖版Ⅰ，3)；葉綠體(Chl)數(shù)量較多，未見明顯腫脹(圖版Ⅰ，4)；質(zhì)體小球(Pb)形狀較大；線粒體(M)輕度腫脹，膜內(nèi)基質(zhì)變淡，嵴斷裂、減少；液泡(V)局部膜破損，細(xì)胞器游離。

彩色斑葉辣椒綠斑區(qū)在所觀察的三個斑區(qū)中異常程度最輕，葉片細(xì)胞呈輕度水腫(圖版Ⅰ，5)；葉綠體(Chl)未見明顯腫脹，其內(nèi)基質(zhì)類囊體連續(xù)、未見擴張，結(jié)構(gòu)顯模糊(圖版Ⅰ，6)；線粒體(M)輕度腫脹，膜內(nèi)基質(zhì)變淡。彩色斑葉辣椒綠斑區(qū)與白色斑葉辣椒綠斑區(qū)超微觀察細(xì)胞器無明顯變化。彩色斑葉辣椒白斑區(qū)葉片細(xì)胞白化改變，中度水腫，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器中度腫脹(圖版Ⅰ，7)，線粒體(M)中度腫脹，明顯變大，線粒體膜內(nèi)基質(zhì)變淡，嵴減少、消失；其他各細(xì)胞器也明顯異常，有少量白色體，膜結(jié)構(gòu)完整，其內(nèi)基質(zhì)均勻(圖版Ⅰ，8)。紫斑區(qū)葉片細(xì)胞也呈中度水腫，各細(xì)胞器異常明顯，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)明顯擴張，脫顆粒、空泡變；過氧化物酶體(PX)少量存在，脂滴(LD)較少(圖版Ⅰ，9)，葉綠體未見明顯腫脹，膜結(jié)構(gòu)完整，其內(nèi)片層結(jié)構(gòu)排列整齊，數(shù)量豐富，基質(zhì)類囊體連續(xù)、未見擴張，結(jié)構(gòu)顯模糊(圖版Ⅰ，10)。彩色斑葉辣椒紫斑區(qū)與紫葉辣椒超微觀察相比，只有線粒體和液泡結(jié)果相近，其他細(xì)胞器表現(xiàn)不同，不同觀察部位超微結(jié)構(gòu)的對比詳見表3。

表3 辣椒葉片不同觀察部位超微結(jié)構(gòu)對比

續(xù)表3 Continued Table 3

3 討 論

葉片顏色主要受葉片中色素種類、含量以及色素在葉片中的空間分布的影響。戴斌等[4]通過對紫色辣椒“黑珍珠”的色素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葉片中花色素主要存在于柵欄組織以及氣孔的2個腎形保衛(wèi)細(xì)胞中。嫩葉表現(xiàn)為綠色而略帶紫色時，花色素苷僅存在于氣孔腎形保衛(wèi)細(xì)胞中，成熟葉呈現(xiàn)紫色是由于花色素苷不僅分布在氣孔腎形保衛(wèi)細(xì)胞中，還存在于葉肉細(xì)胞。本研究結(jié)果與戴斌相同的是彩色斑葉辣椒和紫葉辣椒也均在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和葉肉細(xì)胞內(nèi)觀察到花色素苷分布，紫色深淺程度主要受帶有色素分布的葉肉細(xì)胞數(shù)量影響；不同的是彩色斑葉辣椒花色素苷分布不僅分布在柵欄組織，在海綿組織也有分布，花色素苷積累程度較深的紫色斑區(qū)柵欄組織和海綿組織難以區(qū)分，這可能與材料本身差異有關(guān)。

葉片白斑的顯微觀察報道較少，狗棗獼猴桃和古林箐秋海棠葉片白斑主要是由于葉片表皮細(xì)胞與柵欄組織或柵欄組織內(nèi)存在大量間隙(氣室)，入射光被大量反射導(dǎo)致的[7]。本研究白色斑葉辣椒和彩色斑葉辣椒葉片上均有白色不規(guī)則斑塊，顯微觀察發(fā)現(xiàn)大部分葉肉細(xì)胞嚴(yán)重白化而呈現(xiàn)白色，這與王振興、杜文文等[2]在狗棗獼猴桃和古林箐秋海棠葉斑上的研究結(jié)果不一致，原因可能是上述2種植物的葉斑存在于葉片上表面，白斑是葉片反光而發(fā)白，而本研究中辣椒葉片白斑是葉肉細(xì)胞白化造成的。

異色葉的超微結(jié)構(gòu)觀察主要集中在黃化、淺綠、黃綠等較常見的葉色突變體上。楊莎等[5]利用透射電鏡掃描發(fā)現(xiàn)辣椒葉色黃化突變體葉片葉綠體數(shù)量減少和基粒片層結(jié)構(gòu)減少且排列不整齊，相似的報道還有‘金葉’彎刺薔薇[9]、斑葉銀杏[10]、金葉連翹[11]、建蘭[12]等。本研究中彩色斑葉突變體綠色斑區(qū)葉綠體數(shù)量沒有明顯減少，基粒片層豐富，基質(zhì)類囊體結(jié)構(gòu)模糊，這一結(jié)果與其他作物觀察的結(jié)果不同，可能與作物本身突變機理不同有關(guān)。

Yang Yuxia et al[13]研究紅掌粉紅突變體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)葉綠體沒有完整的類囊體結(jié)構(gòu)，部分葉綠體被線粒體包圍；在白化突變體中，葉綠體被幾乎沒有內(nèi)部結(jié)構(gòu)的囊泡所包圍。黃金亮等[14]觀察芽變突變體全紅楊葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)葉綠體形狀不規(guī)則，基粒片層結(jié)構(gòu)松散；葉肉細(xì)胞很多呈現(xiàn)空泡狀。本研究中辣椒彩色斑葉突變體葉片超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，白色斑區(qū)未觀察到葉綠體，綠色斑區(qū)和紫色斑區(qū)葉綠體未見明顯腫脹，其內(nèi)基質(zhì)類囊體連續(xù)、未見擴張，結(jié)構(gòu)顯模糊，與其他作物葉色突變體觀察結(jié)果不同。

辣椒彩色斑葉突變體葉色的成因是葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體缺失程度不一和花色素苷在葉肉細(xì)胞內(nèi)不均勻分布共同導(dǎo)致的，葉斑類型屬于色素型。研究結(jié)果初步解釋彩色斑葉辣椒復(fù)雜葉色在細(xì)胞水平上的成因。彩色斑葉辣椒葉片超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)白斑區(qū)、紫斑區(qū)細(xì)胞中度水腫，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器變化明顯，白斑區(qū)、紫斑區(qū)葉綠體全部或部分缺失、紫斑區(qū)大量花色素苷積累，為更好地詮釋其內(nèi)在成因，還需從色素代謝與調(diào)控、基因組、轉(zhuǎn)錄組水平開展更深入的研究。