譚國(guó)輝，王澤行，王汝鑫，張?jiān)滦?，任?mèng)凡，陳蘇丹*

（河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000）

本研究采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超聲波提取紫葉李葉片總多酚工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，測(cè)定紫葉李葉片總多酚提取物對(duì)DPPH·、·OH 和O2·的清除能力，為紫葉李的充分利用和發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及主要儀器

在2020 年7 月，于河南科技大學(xué)開(kāi)元校區(qū)采取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害為害的紫葉李葉片。

所用試劑為沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇、福林酚試劑（上海藍(lán)季科技公司）、20%碳酸鈉、DPPH（上海藍(lán)季生物科技公司）、Vc、FeSO4溶液、水楊酸、雙氧水、鄰苯三酚、Tris-HCl、濃鹽酸。所用主要儀器為HX-HH5A4 型恒溫水浴鍋（深圳市力通世紀(jì)科技有限公司）、可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、KQ-500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Allegra TM64Centrifuge 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 紫葉李葉片總多酚物質(zhì)提取

取一定量的紫葉李葉片沖洗干凈，在干燥箱中40℃干燥至恒重。粉碎后過(guò)篩，經(jīng)精密計(jì)算稱(chēng)得0.5g的細(xì)粉，放入100mL 三角瓶中，按相應(yīng)的料液比加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻后用封口膜封住瓶口，然后放在恒溫水浴鍋中，在一定溫度下提取一段時(shí)間，再進(jìn)行超聲提取，在高速冷凍離心機(jī)中離心，取上清液，得到紫葉李葉片多酚提取液。

2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 對(duì)照溶液的制備。量取0.5mL 福林酚試劑于10mL 容量瓶中，后取2mL 20%碳酸鈉溶液與福林酚反應(yīng)，最后定容至10mL。避光靜置2h。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。參照高劍[7]的方法并做適當(dāng)改動(dòng)，得到回歸方程y=1.2728x+0.0455，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。

2.2.3 總多酚得率的計(jì)算。按“2.1”方法制備紫葉李葉片多酚提取液，將提取液定容至50mL，精密量取該溶液1mL，置于10mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇進(jìn)行定容。精確吸取1.0mL 溶液，再置于10mL 容量瓶中定容，在760nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算紫葉李總多酚得率，計(jì)算公式如下：

式中：ρ 為所供試驗(yàn)溶液中總多酚的質(zhì)量濃度（g/L），V 為提取液的體積（mL），K 為總多酚提取液的稀釋倍數(shù)，m 為提取所用紫葉李葉片的質(zhì)量（g）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比。按料液比為1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 分別加入50%乙醇，混合后，在恒溫水浴鍋中60℃下進(jìn)行水浴提取40min，然后在500W 的功率下通過(guò)超聲波提取40min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)。按料液比為1∶90 分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，混合后，在恒溫水浴鍋中60℃下進(jìn)行水浴提取40min，然后在500W 的功率下通過(guò)超聲波提取40min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.3.3 水浴提取溫度。按料液比為1∶90 加入60%的乙醇溶液，混合后，在40、50、60、70、80℃下先進(jìn)行水浴提取40min，然后在500w 的功率下通過(guò)超聲波提取40min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.3.4 超聲提取時(shí)間。按料液比為1∶90 加入60%的乙醇溶液，混勻之后，在40℃下先進(jìn)行水浴提取40min，然后在500w 的功率下通過(guò)超聲波提取20、30、40、50、60min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.4 正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)條件的優(yōu)化結(jié)果，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超聲提取功率為500w 條件下，利用對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、水浴提取溫度和料液比進(jìn)行四個(gè)因素三組合水平的正交試驗(yàn)，確定了紫葉李葉片總多酚最佳超聲輔助提取工藝條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 紫葉李葉片總多酚提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5 紫葉李葉片對(duì)3 種自由基的清除能力測(cè)定方法

2.5.1 紫葉李葉片總多酚對(duì)DPPH·清除能力測(cè)定。使用狄科等[8]和楊艷等[9]中的研究方法并對(duì)其加以適當(dāng)濃度調(diào)整，稱(chēng)取0.0099g 的DPPH，并用無(wú)水乙醇稀釋至250mL。取不同質(zhì)量濃度的總多酚溶液2mL 于試管內(nèi)，分別加入制備的0.1mol/L 的DPPH 乙醇溶液2mL 于試管內(nèi)?；靹蚝?，在黑暗室溫條件下反應(yīng)30min，在517nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度A1，測(cè)量0.1mol/L 的DPPH乙醇溶液2mL 和無(wú)水乙醇2mL 的混合液的吸光度A2，及不同質(zhì)量濃度的總多酚溶液2mL 和2mL 無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)0，以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，DPPH·清除率（Y）計(jì)算公式（2）為：

2.5.2 紫葉李葉片總多酚對(duì)羥基自由基的清除能力測(cè)定。采用閆旭宇等[10]的方法并進(jìn)行修改。稱(chēng)取0.0912g的7H2O·FeSO4、0.0829g 水楊酸，分別用無(wú)水乙醇定容至100mL。取不同質(zhì)量濃度總多酚溶液2mL，依次加入2mL 濃度為6mmol/L 的硫酸亞鐵、30%的過(guò)氧化氫和水楊酸溶液，避光反應(yīng)30min，在4000r/min 的轉(zhuǎn)速下離心10min，在510nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣液的吸光度，記為A1。用蒸餾水代替上述水楊酸溶液，按上述條件下反應(yīng)，記為A2；用蒸餾水代替上述總多酚溶液，在上述條件下反應(yīng)，記為A0。以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，同等條件下反應(yīng)。根據(jù)公式計(jì)算清除率。羥基自由基清除率（Y）計(jì)算公式（3）為：

2.5.3 紫葉李葉片總多酚對(duì)O2·的清除能力測(cè)定。采用謝碧秀等[11]及張蕾等[12]的方法并進(jìn)行修改。稱(chēng)取0.3153g 鄰苯三酚于100mL 容量瓶中，用10.00mmol/L的鹽酸定容，制成25.00mmol/L 溶液；0.2mol/L 的Tris溶液50mL 與0.2mol/L 的HCl 溶液21.9mL 混勻，稀釋至200mL。于試管中分別加入0.05mol/L 的Tris-HCL溶液（pH 值8.2）4.5mL，置于25℃水浴20min。加入不同質(zhì)量濃度的多酚溶液2mL 和25℃保溫過(guò)的鄰苯三酚（10mol/LHCl 配置）0.08mL，加入后快速搖勻，25℃恒溫水浴4min 后，立即加入2 滴8mol/L 的HCl，終止反應(yīng)，并測(cè)定325nm 波長(zhǎng)下的吸光值，用Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照。O2·清除率（4）計(jì)算公式為：

3 結(jié)果與分析

3.1 紫葉李葉片總多酚提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對(duì)總多酚提取的影響。由圖1 可知，隨著料液比的減小，紫葉李葉片總多酚得率在1∶60～1∶80 相對(duì)平緩地增加，但當(dāng)料液比到達(dá)1∶90 時(shí)，總多酚得率達(dá)到峰值，此時(shí)總多酚得率為2.56mg/g。當(dāng)料液比超過(guò)1∶90 后，總多酚得率下降，可能是因?yàn)樵?∶90 總多酚的溶解率達(dá)到飽和。故選取1∶90 為宜。

圖1 料液比對(duì)紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚提取的影響。由圖2 可知，紫葉李葉片總多酚得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～40%時(shí)上升較快，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時(shí)上升緩慢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%時(shí)，總多酚得率達(dá)到峰值，為2.03mg/g。繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，得率降低。在提取的溶液含量過(guò)高時(shí)，由于某些化合物如醇溶性雜質(zhì)等成分溶出量增多，導(dǎo)致總多酚不易溶出，從而引起總多酚得率降低，還增加了成本，考慮到提取得率和成本，最后確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%為佳。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)總多酚提取的影響。由圖3 可知，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為20～40min 時(shí)，得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到40min 時(shí)，最高為1.97mg/g。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40min 時(shí)，得率緩慢下降。這可能是因?yàn)榭偠喾泳哂卸喾恿u基，很容易被空氣中的氧氣氧化。長(zhǎng)時(shí)間加熱后會(huì)分解，得率降低。因此，最佳提取時(shí)間為40min。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.1.4 提取溫度對(duì)總多酚提取的影響。由圖4 可知，當(dāng)提取溫度為30～40℃時(shí)，得率迅速增加，在40℃時(shí)達(dá)到最大值，為2.12mg/g。當(dāng)提取溫度超過(guò)40℃時(shí)，得率緩慢下降。但當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí)，總多酚的結(jié)構(gòu)容易被氧化破壞，乙醇容易揮發(fā)。同時(shí)，雜質(zhì)的溶解也會(huì)增加，導(dǎo)致總多酚的減少，得率下降。因此，最佳萃取溫度為40℃。

圖4 提取溫度對(duì)紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.2 紫葉李葉片總多酚提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 中的極差R 數(shù)據(jù)分析得知，正交試驗(yàn)提取條件中的4 個(gè)因素，對(duì)總多酚物質(zhì)提取率的影響程度依次為D＞A＞C＞B，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞水浴提取溫度＞超聲提取時(shí)間。從實(shí)測(cè)值差異顯著性數(shù)據(jù)k1～k3可以得出，紫葉李中總多酚的超聲最佳提取工藝條件參數(shù)為A2B2C2D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶80g/mL、水浴提取溫度為40℃和超聲提取時(shí)間為40min。對(duì)得到的最佳工藝提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得3 次總多酚得率的平均值為4.75mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.16%，表明此工藝是有效的。

表2 紫葉李葉片總多酚提取的正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.3 紫葉李葉片總多酚對(duì)3 種自由基清除能力測(cè)定分析

3.3.1 紫葉李葉片總多酚對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定結(jié)果。由圖5 可知，紫葉李葉片總多酚和Vc 對(duì)DPPH·均具有一定清除效果，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸提高。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.03mg/mL 時(shí)，Vc 對(duì)DPPH·的清除率的上升趨勢(shì)緩慢，0.03、0.04mg/mL 時(shí)，二者清除率分別增加8.5%和10.5%，紫葉李葉片總多酚上升趨勢(shì)較Vc 快；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.04mg/mL 時(shí)，二者對(duì)DPPH·的清除能力均達(dá)到頂峰，此時(shí)紫葉李葉片總多酚的清除率達(dá)到53.3%，Vc 的清除率達(dá)到72.7%。與同一質(zhì)量濃度的Vc 相比，紫葉李葉片總多酚對(duì)DPPH·具有一定的清除能力。

圖5 紫葉李葉片總多酚對(duì)DPPH·的清除作用

3.3.2 紫葉李葉片總多酚對(duì)·OH 清除率的測(cè)定結(jié)果。由圖6 可知，紫葉李葉片總多酚和Vc 對(duì)·OH 的清除效果，都隨著其質(zhì)量濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.04mg/mL 時(shí)，二者對(duì)·OH 的清除能力達(dá)到頂峰，紫葉李葉片總多酚的清除率達(dá)到70.7%，Vc 的清除率達(dá)到86.7%。與同等質(zhì)量濃度的Vc 相比，紫葉李葉片總多酚對(duì)·OH 具有一定的清除能力。

圖6 紫葉李葉片總多酚對(duì)·OH 的清除作用

3.3.3 紫葉李葉片總多酚對(duì)O2·清除率的測(cè)定結(jié)果。由圖7 可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.02mg/mL 時(shí)，紫葉李葉片總多酚和Vc 的清除率分別為70.0%和87.8%；質(zhì)量濃度大于0.02mg/mL 時(shí)，紫葉李葉片總多酚和Vc 對(duì)O2·的清除能力趨于穩(wěn)定上升。質(zhì)量濃度為0.04mg/mL 時(shí)，二者對(duì)O2·的清除能力達(dá)到最大，紫葉李葉片總多酚的清除率為78.67%，Vc 的清除率為90.48%。與同一質(zhì)量濃度的Vc 相比，紫葉李葉片總多酚對(duì)O2·具有良好的清除能力。

圖7 紫葉李葉片總多酚對(duì)O2·的清除作用

4 討論與結(jié)論

汪洪濤等[1]對(duì)紫葉李果實(shí)總多酚提取工藝的研究結(jié)果表明，在最佳工藝下提取的總多酚得率為18.13mg/g；高劍等[7]報(bào)道，紫葉李皮中總多酚在最優(yōu)提取工藝下的得率為55.3mg/g；Song W[13]等測(cè)定紫葉李葉片中提取的總多酚得率為（117.8±8.8）mg/g，枝條中提取的總多酚得率為（100.04±1.9）mg/g；而本研究發(fā)現(xiàn)紫葉李不同部位的總多酚含量存在一定的差異，并且紫葉李總多酚的含量受栽培類(lèi)型、提取方法、成熟度、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)季節(jié)、生長(zhǎng)地區(qū)等的影響。

茹巧美等[14]研究表明，紫蘇葉多酚對(duì)DPPH·、·OH和O2·的IC50 分別為70.81，60.21，73.44μg/mL；李芬芳等[15]研究表明，當(dāng)草莓多酚濃度為0.16mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到93.33%，對(duì)·OH 抑制率達(dá)78.68%，抗超氧陰離子能力達(dá)165.16U/L；楚紅英等[16]抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)金錢(qián)草多酚濃度為500μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH 和O2-·的清除率分別為68.3%、87.6%、88.0%。通過(guò)比較分析得出，紫葉李葉片多酚提取物具有良好的抗氧化能力，對(duì)O2·的清除能力較好，與同一質(zhì)量濃度的Vc 相比，清除能力稍低，并且總多酚的抗氧化能力受多酚濃度、植物種類(lèi)、提取方法和提取部位等的影響。這為紫葉李多酚的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供依據(jù)和參考。