楊宏飛 張啟杰 邵良發(fā)

肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種進行性疾病，其可增加肺血管阻力，從而發(fā)展為右心室肥大和衰竭，這是PAH死亡的原因[1]。由于PAH的病因多樣，目前尚無長期有效的治療方法[2]。PAH的主要標志是內(nèi)皮細胞(Endothelial cell，EC)功能障礙，因此關(guān)注內(nèi)皮功能的改善可能是一種有效的方法[3]。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是內(nèi)皮功能障礙的復(fù)雜事件，先前的研究表明EndMT發(fā)生在PAH小鼠和患者中[4]。然而，EndMT在MCT誘導(dǎo)的PAH中的調(diào)節(jié)機制尚不清楚。整聯(lián)蛋白連接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)是整合素和生長因子信號通路的交聯(lián)結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于各種類型的細胞中，在傳遞細胞信號信息方面起著至關(guān)重要的作用。ILK與整聯(lián)蛋白β1和β3亞基相互作用，并參與整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。目前，大量研究證實ILK過表達促進血管內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT[6-7]。此外，ILK促進肺泡和氣道上皮細胞的增殖，并導(dǎo)致發(fā)育中的肺部形態(tài)發(fā)生改變[8]。所有這些結(jié)果提示ILK可能參與PAH相關(guān)的EndMT過程。但是，ILK在PAH中的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究確定了ILK在實驗性PAH模型中表達情況，分析其在PAH病理中的作用，并通過生物信息技術(shù)確定了ILK的潛在靶基因，以探索其調(diào)控EndMT的潛在機制。

資料與方法

一、動物模型與血流動力學(xué)測量

96只SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～220g)從遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司購買，并飼養(yǎng)在標準環(huán)境中。所有動物自由獲得食物和水。在實驗1中，大鼠(n=24)隨機分為對照組和野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的PAH(MCT-PAH)組，每組12只。MCT-PAH組大鼠經(jīng)皮下注射了60 mg/kg MCT(美國MedChem Express公司)注射建立PAH模型。對照組(n=12)注射相同體積的溶媒溶液。

此外，在實驗2中，動物(n=72)隨機分為4組，每組18只：對照組、MCT-PAH組、MCT-PAH+sh-ILK組和MCT-PAH+sh-NC組。sh-ILK或sh-NC(由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司構(gòu)建)分別在MCT治療前48h，MCT治療后第7天和第14天經(jīng)鼻內(nèi)遞送給大鼠(每只大鼠2×108TU/mL)。

注射MCT后21天，麻醉大鼠，測量血流動力學(xué)。用BL-420S生物數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)和導(dǎo)管連接的壓力傳感器記錄右心室收縮壓(RVSP)和平均肺動脈壓(mPAP)。血液動力學(xué)測定后，收集大鼠肺組織作進一步檢查。實驗1：每組取6只大鼠進行免疫熒光染色，每組取6只動物進行ELISA分析。實驗2：每組6只大鼠進行蛋白檢測，每組6只大鼠進行組織學(xué)檢查，其余動物(n=6/組)進行心室重構(gòu)測量。

二、細胞培養(yǎng)

根據(jù)先前的研究[9]，從正常雄性SD大鼠的肺動脈中分離出大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞(rat pulmonary arterial endothelial cells，rPAEC)。在含有10%胎牛血清(FBS；美國Hyclone公司)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM；美國Gibco公司)中培養(yǎng)細胞。 每2天更換一半培養(yǎng)基，每3～4天傳代一次細胞。第三次傳代后，將細胞用于實驗。將5 ng/mL TNF-α(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)、5 ng/mL TGFβ1(武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司)和0.1 ng/mL IL-1β(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)添加到rPAECs生長培養(yǎng)基中誘導(dǎo)EndMT(I-EndMT)。在以下實驗中分別檢測在第2天、第4天和第6天I-EndMT細胞中ILK的表達。

三、慢病毒構(gòu)建

對于過表達慢病毒構(gòu)建，使用的寡核苷酸序列(5′-3′)為：ILK正義gatccgAACATTCATTGCTGTCG GTGGGTttcaagagaACCCACCGAGCAATGAATGATTTTT tttta和反義agcttaaaaaaAAAACATTCATTGCTCGGTGG GTtctcttgaaACACACACCGACAGC；NC 正義tTTCTCCG AACGTGTCACGTttcaagagaACGTGACACGTTCGGAGA AAttttttc和反義tcgagaaaaaaTTCTCCGAACGTGTCA CGTtctcttgaaACGTGACACGTTCGGAGAAa。對于沉默慢病毒構(gòu)建，使用的寡核苷酸序列(5′-3′)是：ILK正義tgACCCACCGACAGCAATGAATGTTttcaagagaAACA TTCATTGCTGTCGGTGGGTTTttttc和反義tcgagaaaaaa ACCCACCGACAGCAATGAATGTTtctcttgaaAACATTCT GGTG；NC正義tgTTCTCCGAACGTGTCACGTttcaagaga ACGTGACACGTTCGGAGAAAttttttc和反義tcgagaaa aaaTTCTCCGAACGTGTCACGTtctcttgaaACGTGACACG TTCGGAGAAca。將過表達或沉默ILK的序列插入與pSico慢病毒載體系統(tǒng)(美國Addgene公司)的HapI和XhoI限制性酶切位點之間。

四、右室肥厚指數(shù)(RVHI)的測定

收獲右心室(RV)，左心室(LV)和中隔(S)并稱重。然后通過RV /(LV + S)的比率計算RVHI，以評估右心室重塑。

五、蘇木和曙紅(HE)和免疫熒光染色

將肺組織固定在低聚甲醛中，包埋在石蠟中，并切成5 μm厚的載玻片。使用HE染色試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司)進行染色以評估肺血管重塑。從每只大鼠一個切片，并在3個隨機視野中測量肺動脈，通過以下公式評估肺動脈壁厚度：(外徑-內(nèi)徑)/外徑×100%。

對于雙標記免疫熒光，肺部切片用CD31抗體(1 ∶100；英國Abcam公司)和α-SMA抗體(1 ∶100；英國Abcam公司)的一級抗體在4℃孵育過夜。然后使用特異性二抗：FITC標記的山羊抗小鼠抗體(1 ∶200；上海Beyotime公司)和Cy3標記的山羊抗兔抗體(1 ∶200；上海Beyotime公司)在37℃下孵育1h。使用DMIL倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)獲取圖像。

六、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

收集肺組織的上清液，用BCA蛋白測定試劑盒(北京Solarbio公司)定量蛋白質(zhì)濃度。然后，通過ELISA試劑盒(購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)測量TNF-α、TGFβ1和IL-1β的濃度。

七、 Western blot

收獲肺組織或rPAEC，并用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(北京Solarbio公司)進行裂解。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。然后，將相同體積的蛋白質(zhì)樣品分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF；美國EMD Millipore公司)上，用5%脫脂乳封閉1 h。膜用一抗免疫印跡孵育過夜。一抗包括：ILK(1 ∶500；英國Abcam公司)，VE-cadherin(1 ∶400；武漢Boster公司)，N-cadherin(1 ∶1000；武漢Boster公司)，Vimentin(1 ∶1000；武漢Boster公司)，TLR2(1 ∶1000；美國CST公司)和GAPDH(1 ∶10000；美國Proteintech公司)。然后使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔(1 ∶3000；Solarbio)或山羊抗小鼠(1 ∶3000；Solarbio)二抗孵育1h，并通過化學(xué)發(fā)光法進行檢測。

八、微陣列分析

一對rPAEC細胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ILK基因的rPAEC細胞和相應(yīng)的陰性對照)用于微陣列分析。具體操作為，從細胞中提取的總RNA被擴增并轉(zhuǎn)錄成熒光互補DNA(cDNA)，然后與8×60K mRNA表達微陣列。用Agilent掃描儀G2505B對陣列進行掃描。使用genespringxv11.5軟件包對采集的數(shù)據(jù)進行標準化并通過GEO數(shù)據(jù)庫收集轉(zhuǎn)錄組GSE113439數(shù)據(jù)集進行分析。最后，選擇折疊變化≥2.0且P<0.05的mRNAs作為差異表達mRNAs。

九、統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用Graphpad Prism7.0軟件進行，結(jié)果以平均值±標準差表示。兩組定量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗的方法；多組定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多組之間多重比較采用Tukey事后檢驗進行分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中EndMT

為了探討MCT注射后PAH大鼠的癥狀，研究首先確定了血流動力學(xué)。如圖1A和B所示，MCT誘導(dǎo)的大鼠的RVSP(圖1A)和mPAP(圖1B)高于對照組(P<0.001)。為了確定MCT-PAH大鼠模型中EndMT細胞的存在，在MCT-PAH大鼠的肺切片中觀察到CD31和α-SMA的共表達，而在對照組織中則很少(圖1C)。圖1D的結(jié)果表明PAH增加了炎癥細胞因子的濃度，包括TNF-α、TGFβ1和IL-1β。 此外，與對照組相比，ILK在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠中表達顯著上調(diào)(P<0.001)(圖1E)。

二、 ILK敲低改善MCT-PAH大鼠肺動脈高壓、肺動脈肥大和右心室重構(gòu)

首先，在sh-ILK慢病毒感染的MCT-PAH大鼠肺組織中觀察到ILK蛋白表達較對照組顯著下調(diào)(P<0.05)(圖2A)。接下來觀察了ILK下調(diào)對PAH癥狀的影響。如圖2B和C所示，ILK敲低顯著降低MCT誘導(dǎo)的RVSP升高(圖2B)和mPAP升高(圖2C)。肺組織的組織學(xué)結(jié)果顯示，與MCT-PAH大鼠相比，ILK敲低降低了肺動脈壁的厚度(圖2D和E)。此外，ILK敲低改善了MCT-PAH誘導(dǎo)的RVHI上調(diào)(圖2F)。

圖1 在MCT誘導(dǎo)的PAH實驗?zāi)Ｐ椭袡z測到EndMT。A和B：通過血液動力學(xué)測量MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠RVSP(A)和mPAP(B)水平。C：肺部免疫熒光分析顯示在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠中CD31(綠色)和α-SMA(紅色)共定位(×400)。白色箭頭表示共定位。比例尺=50 μm(×400)。D：ELISA法檢測MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠血清中炎性細胞因子(TNF-α、TGFβ1和IL-1β)的含量(×400)。E：Western blot檢測MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中ILK蛋白表達。與對照組相比，***P<0.001。

圖2 ILK敲低改善MCT-PAH大鼠肺動脈高壓、肺動脈肥大和右心室重構(gòu)。A：Western blot結(jié)果顯示sh-ILK慢病毒感染可逆轉(zhuǎn)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠ILK水平上調(diào)。B和C：ILK敲低抑制MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠RVSP(B)和mPAP(C)上調(diào)。D和E：HE染色顯示ILK敲低對PAH大鼠肺壁厚度有抑制作用(×400)。比例尺=50μm。F：ILK敲低降低MCT-PAH大鼠RVHI。與對照組相比，**P<0.01、***P<0.001；與MCT-PAH+sh-NC組，#P<0.05。

三、 ILK敲低阻斷EndMT

為了了解ILK在EndMT中的作用，利用Western blot測定肺組織EndMT標記物的變化。結(jié)果顯示，與MCT-PAH+sh-NC組相比，MCT-PAH+sh-ILK組肺組織中VE-cadherin蛋白的表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，并且N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)(圖3A和B)。在體外研究中，在I-EndMT第4天和第6天rPAECs細胞中ILK蛋白表達較對照組顯著上調(diào)(P<0.001)(圖4A和B)。此外，與體內(nèi)結(jié)果一致，ILK敲低逆轉(zhuǎn)了I-EndMT誘導(dǎo)的rPAECs細胞中VE-cadherin減少和N-cadherin、Vimentin增加(圖4C和D)。

圖3 ILK敲低減弱MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠EndMT過程。A和B：Western blot結(jié)果顯示ILK敲低逆轉(zhuǎn)了MCT誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞標志物(VE-cadherin)的減少和間充質(zhì)細胞標志物的增加(N-cadherin和Vimentin)。與對照組相比，***P<0.001；與MCT-PAH+sh-NC組，#P<0.05、##P<0.01。

圖4 ILK敲低減弱rPAECs進行I-EndMT。A和B：Western blot檢測炎性細胞因子誘導(dǎo)rPAEC發(fā)生EndMT過程中ILK蛋白表達變化。C和D：Western blot顯示ILK敲低逆轉(zhuǎn)了I-EndMT誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞標志物(VE-cadherin)的減少和間充質(zhì)細胞標志物的增加(N-cadherin和Vimentin)。與對照組相比，***P<0.001；與I-EndMT+sh-NC組，#P<0.05、##P<0.01。

四、 ILK靶向TLR2

為了鑒定ILK誘導(dǎo)作用的潛在介體，利用微陣列技術(shù)的GSE數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)染了ILK或非靶向性對照LV-NC的rPAECs進行了差異表達基因分析。基于生物信息技術(shù)，研究確定了一系列在轉(zhuǎn)染了ILK的rPAECs細胞中高表達的基因，包括TLR2(圖5A)。然后，研究測試了TLR2在I-EndMT rPAEC中的變化。如(圖5B-C)所示，與對照組相比，I-EndMT顯著增加了rPAECs中TLR2蛋白表達(P<0.001)，這被ILK敲低所阻止(P<0.01)。

圖5 ILK靶向TLR2。A：選擇GSE113439分析在轉(zhuǎn)染了ILK或非靶向性對照LV-NC的rPAECs中均發(fā)生變化的差異表達基因，并通過熱圖顯示了前26個差異表達基因。綠色和紅色分別代表下調(diào)和上調(diào)。B和C：Western blot顯示I-EndMT可增加rPAECs中TLR2蛋白水平，而ILK敲低可降低TLR2表達。與對照組相比，***P<0.001；與I-EndMT+sh-NC組，##P<0.01。

討 論

PAH是一種復(fù)雜的心血管疾病，死亡率很高。肺動脈重塑逐漸導(dǎo)致肺血管阻力和肺動脈壓力增加，并最終引發(fā)右心室衰竭和死亡[1]。最近研究證實，EndMT在肺動脈重塑中起關(guān)鍵作用，進行End-MT的肺動脈ECs具有間充質(zhì)樣細胞的遷移能力并滲透到肺動脈介質(zhì)中[10]。ILK是一種分子量為59kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它是整聯(lián)蛋白和生長因子信號通路的交聯(lián)結(jié)構(gòu)蛋白[5]。ILK作為銜接蛋白在各種細胞類型中廣泛表達，并能作為蛋白激酶調(diào)節(jié)細胞骨架裝配和來自粘著部位的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，ILK對腫瘤微環(huán)境中內(nèi)皮細胞的EndMT分化至關(guān)重要[11]。因此，本研究重點分析了MCT-PAH中ILK與EndMT進程之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，ILK敲低抑制了MCT-PAH大鼠的肺動脈高壓，肺動脈肥大，右心室重構(gòu)和EndMT進程。此外，體外實驗進一步證實rPAEC中的ILK敲低可以使EndMT進程減弱。觀察結(jié)果支持ILK通過直接靶向TLR2參與EC的EndMT來促進PAH。

眾所周知，MCT暴露通常用于模擬PAH的癥狀[12]。在本研究中，MCT大鼠的病理變化包括RVSP、mPAP和炎性細胞因子的增加，肺動脈壁增厚以及右心室肥大，這與以前的研究一致[12]，表明成功建立了PAH動物模型。在PAH大鼠中，我們還觀察到ILK表達明顯升高，表明它可能與PAH的發(fā)生和進程有關(guān)。此外，ILK敲低減少了PAH大鼠的RVSP、mPAP、肺動脈重塑和右心室重塑的改變。這些結(jié)果表明，ILK是PAH的潛在誘發(fā)因素。在進一步分析ILK在PAH誘導(dǎo)的EndMT中的作用時發(fā)現(xiàn)，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中存在CD31和α-SMA共表達，表明在PAH大鼠中存在EndMT[13]。重要的是，ILK敲低可減少內(nèi)皮標志物并增加間充質(zhì)標志物表達。這些結(jié)果表明，ILK對PAH高血壓和血管重構(gòu)的誘導(dǎo)作用可能歸因于促進EndMT。

EndMT代表炎癥應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙之間復(fù)雜相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)PAH和系統(tǒng)性硬化癥患者血清中的TNF-α和IL-1β等炎性細胞因子升高[2]。一致地，本研究觀察到MCT-PAH大鼠中TNF-α、TGFβ1和IL-1β升高。在單用TNF-α、IL-1β或TGFβ1刺激下，EndMT通過多種信號傳導(dǎo)途徑在不同的內(nèi)皮細胞中被誘導(dǎo)[14]。另外，Good等研究結(jié)果顯示，TNF-α、IL-1β和TGFβ1組合可誘導(dǎo)PAECs的EndMT，并且EndMT細胞表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)變化以及內(nèi)皮和間充質(zhì)標志物的變化[15]。本研究表明，rPAECs響應(yīng)TNF-α、TGFβ1和IL-1β的組合并向間充質(zhì)細胞表型過渡。ILK的表達在I-EndMT細胞中升高，其敲低減弱了I-EndMT的過程。這些體外結(jié)果表明ILK敲低通過抑制EndMT對內(nèi)皮功能障礙產(chǎn)生有益影響。此外，基于生物信息技術(shù)，研究確定了TLR2作為ILK潛在靶基因。TLR2已被證明可調(diào)節(jié)心臟和腎臟組織以及主動脈瘤和主動脈狹窄中血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[16]?？紤]到炎癥也是EndMT和內(nèi)皮功能障礙的誘導(dǎo)因素[17]，支持了本研究中ILK通過直接靶向TLR2，誘導(dǎo)EndMT并促進PAH發(fā)展的結(jié)論。

總之，本研究數(shù)據(jù)證實EndMT過程可以發(fā)生在PAH的肺內(nèi)皮細胞。此外，ILK通過靶向TLR2參與EndMT過程。這些發(fā)現(xiàn)提示ILK正性調(diào)節(jié)TLR2，從而在MCT誘導(dǎo)的PAH中促進EndMT，可作為PAH治療的新靶點。