何述棟 ，王雍飛 ，潘姝曉 ，李興江 ，王家良 ，繆新亞 ，王振山 ，孫漢巨

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，合肥 230061；2.蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽蚌埠 233030；3.安徽湘園食品科技有限公司，安徽蚌埠 233400；4.匯福糧油泰州有限公司，江蘇泰州 225327）

0 引言

安徽省懷遠(yuǎn)縣地處淮河流域腹地，氣候適宜糯稻種植，是我國(guó)最大的糯米生產(chǎn)基地和交易集散地［1］。糯米是糯稻脫殼后的產(chǎn)品，北方俗稱(chēng)江米［2］，按照形狀、黏度和種植區(qū)域分為梗糯和秈糯。糯米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)，大量的鈣、磷、鐵等金屬元素以及維生素B1、維生素B2和煙酸等微量元素［3］。糯米具有補(bǔ)中益氣、健脾養(yǎng)胃和潤(rùn)肌養(yǎng)顏的功效。因此，糯米深受我國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)，是我國(guó)諸多傳統(tǒng)食物，如年糕、八寶粥、粽子、湯圓等的重要原材料，也是釀制黃酒的主要來(lái)源［4］。隨著現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)健康食品的發(fā)展，以糯米淀粉和蛋白質(zhì)為原料開(kāi)發(fā)保健功能性食品成為新的市場(chǎng)關(guān)注點(diǎn)，前景巨大。然而，由于農(nóng)村當(dāng)?shù)厝狈ε疵拙罴庸つ芰?，無(wú)法滿足農(nóng)業(yè)增收、農(nóng)民增收的新需求。我國(guó)相關(guān)糧食作物研究多以大米為主，關(guān)于糯米的研究和開(kāi)發(fā)報(bào)道較少。傳統(tǒng)糯米深加工以水磨法制備糯稻淀粉為主，存在著得率低、能耗高的實(shí)際問(wèn)題［5］，廢水中含有大量的水溶性蛋白，造成了浪費(fèi)和環(huán)境污染，蛋白質(zhì)和淀粉分子均被植物細(xì)胞所束縛。因此，本文嘗試采用酶法輔助破壞糯米結(jié)構(gòu)，有效增加蛋白質(zhì)和淀粉分子的溶出率，結(jié)合膠體磨和離心處理，通過(guò)物理特性差異同時(shí)制備糯米淀粉和蛋白質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果可為糯稻綜合加工的全面開(kāi)展奠定基礎(chǔ)，降低廢水污染，提升產(chǎn)品附加值，具有較好的實(shí)際生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米原料：安徽湘園食品科技有限公司提供，產(chǎn)自安徽省懷遠(yuǎn)縣，收獲年份為2019年。纖維素酶（來(lái)源于黑曲霉，10 000 u/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；果膠酶（來(lái)源于黑曲霉，10 000 u/g，北京百靈威科技有限公司）。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華（常州）儀器制造有限公司）；FW100型小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海楚定分析儀器有限公司）；JMFB-80型膠體磨（上海科勞機(jī)械設(shè)備有限公司）；TGL18M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；K1160型凱氏定氮裝置（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶法輔助膠體磨同時(shí)提取糯米蛋白質(zhì)和淀粉的工藝

取一定量的糯米樣品用蒸餾水洗滌2次，粗粉碎后，加入與糯米質(zhì)量比1：10的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值，加入酶制劑，在一定溫度下酶解一段時(shí)間后，采用膠體磨碾磨成糯米漿，在4 ℃經(jīng)6 500 rad/min離心作用后，獲得富含蛋白質(zhì)的上清液和富含淀粉的濾餅。上清液經(jīng)乙醇逆流交換后，蛋白質(zhì)析出，42 ℃干燥，得糯米蛋白粉；糯米粉餅經(jīng)50 ℃干燥后，得糯米淀粉（水分含量小于12.5%）。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

原料以及烘干蛋白粉的粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法）進(jìn)行測(cè)定。

水提上清液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定，以系列濃度（mg/mL）牛血清白蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250染色后在595 nm處的相應(yīng)吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］。

式中 m1——水提上清液中蛋白質(zhì)含量；

m2——原料中蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 糯米淀粉含量的測(cè)定

依據(jù)GB 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測(cè)定》，采用酸水解法（第二法）對(duì)原料中糯米粗淀粉含量進(jìn)行測(cè)定。

式中 m3—— 膠體磨離心沉淀的糯米粉餅淀粉質(zhì)量；

m4——原料中淀粉質(zhì)量。

1.3.4 糯米水分含量的測(cè)定

糯米粗水分含量的測(cè)定采用GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法（第一法）。

1.4 酶法輔助單因素優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 酶種類(lèi)的選擇

按工藝處理物料，分別加入物料重0.8%的纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和果膠酶的復(fù)配（活性比1：1），進(jìn)行后續(xù)處理，確定酶種類(lèi)。

1.4.2 酶添加量的確定

按工藝處理物料，分別加入物料重0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%確定酶的量，進(jìn)行后續(xù)處理，確定最佳酶添加量。

1.4.3 酶解時(shí)間的確定

按工藝處理物料，添加已確定的酶和量，分別酶解 30，45，60，75，90 min，進(jìn)行后續(xù)處理，確定最優(yōu)酶解時(shí)間。

1.4.4 酶解pH值的確定

按工藝處理物料，調(diào)節(jié)pH值至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，添加已確定的酶和量，按最優(yōu)酶解時(shí)間進(jìn)行后續(xù)處理，確定最佳pH值。

1.4.5 酶解溫度的確定

按工藝處理物料，調(diào)節(jié)到最佳pH值，添加已確定的酶和量，分別在40，50，60 ℃按最優(yōu)時(shí)間進(jìn)行酶解，再進(jìn)行后續(xù)處理，確定酶解溫度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)最少進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±SD值表示；采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著；采用Origin軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米原料的基本成分

經(jīng)測(cè)定，試驗(yàn)用糯米原料的基本成分組成：粗水分含量為（11.5±1.2）%，粗蛋白質(zhì)含量為（6.72±0.30）%，粗淀粉含量為（73.5±2.5）%。

糯米的主要組分是淀粉。糯稻是稻的黏性變種，其支鏈淀粉含量可達(dá)95%以上，因此加熱可形成獨(dú)特的黏性口感。依據(jù)糯稻的種植地域，不同品系的糯米其基本成分組成略有不同［7］。

2.2 酶種類(lèi)的選擇

傳統(tǒng)的糯米蛋白質(zhì)或淀粉的提取研究多以酶法為主［8］，常采用蛋白酶或淀粉酶，以水解某一主要成分為主要技術(shù)手段，而富集另外一個(gè)主要組分，不能同時(shí)制備2個(gè)完整的大分子。基于細(xì)胞破壁考慮，試驗(yàn)擬采用纖維素酶、果膠酶以及纖維素酶和果膠酶的復(fù)配（活力比1：1）分別處理糯米細(xì)胞壁，使水溶性蛋白和包裹其中的淀粉盡量釋放出來(lái)，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶種類(lèi)對(duì)同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.1 Effect of enzyme types on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

單酶酶解效果好于復(fù)合酶的處理，且果膠酶協(xié)同膠體磨制備了較高提取率的糯米蛋白質(zhì)和淀粉（P<0.05），這與鄭典元等［9］對(duì)褐藻的酶處理結(jié)果相似。植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素和果膠，而糯米細(xì)胞間質(zhì)的主要成分是果膠。因此，果膠酶在破開(kāi)植物細(xì)胞壁的胞間層，解離細(xì)胞組織方面，會(huì)優(yōu)于纖維素酶，緊接著在膠體磨作用力下，可以釋放出較多的水溶性蛋白和淀粉分子［10］。纖維素酶可以水解細(xì)胞中 β -1，4 糖苷鍵鏈接的非淀粉多糖，導(dǎo)致膠體磨沉淀物的相對(duì)降低以及上清液組分的一定增多。在表觀試驗(yàn)結(jié)果上，雙酶復(fù)合處理呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)提取率與纖維素酶單酶處理差異不顯著（P >0.05），但淀粉得率顯著降低（P<0.05）的現(xiàn)象。根據(jù)江婭梅［11］采用纖維素酶和果膠酶對(duì)南瓜漿處理的研究報(bào)道可知，果膠酶在50 ℃時(shí)的酶解活力要好于纖維素酶，這也可能是本試驗(yàn)現(xiàn)象的一個(gè)原因。因此，在后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)選果膠酶進(jìn)行處理。

2.3 酶添加量的確定

采用果膠酶處理浸泡糯米，酶添加量對(duì)膠體磨同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響如圖2所示。當(dāng)果膠酶添加量比重為0.6%時(shí)，果膠酶對(duì)膠體磨同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響顯著提升。當(dāng)添加量為0.8%時(shí)，同時(shí)獲得最高的蛋白質(zhì)提取率40.50%和最高的淀粉得率90.90%。隨著酶添加量的繼續(xù)提高，得率并未有顯著提升，反而略有下降。隨著酶添加量的增加，果膠酶水解膠質(zhì)的反應(yīng)速率加快，利于糯米顆粒破壁，使蛋白質(zhì)和淀粉從細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間溶出，但是過(guò)量的果膠酶無(wú)法獲得更多的酶作用位點(diǎn)，提取率不會(huì)繼續(xù)顯著提升。因此，試驗(yàn)優(yōu)選果膠酶添加比重為0.8%繼續(xù)進(jìn)行單因素優(yōu)化研究。

圖2 酶添加量對(duì)同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.4 酶解時(shí)間的確定

酶解時(shí)間對(duì)膠體磨同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響如圖3所示。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，糯米蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均呈現(xiàn)緩慢增加的變化趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，糯米蛋白質(zhì)和淀粉得率后續(xù)變化差異不顯著（P>0.05），差異幅度較小，表明果膠酶在60 min時(shí)已基本與糯米顆粒結(jié)合完全，酶解較充分，繼續(xù)增加酶解時(shí)間無(wú)法繼續(xù)提高酶反應(yīng)效率。因此，從經(jīng)濟(jì)成本考慮，試驗(yàn)確定60 min為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.5 酶解pH值的確定

依據(jù)Osborne分級(jí)法，糯米等稻谷蛋白一般由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白組成［12］。其中，清蛋白溶于水，球蛋白易溶于鹽溶液，2者約占蛋白總含量的4%～15%；谷蛋白約占蛋白總量的80%，多溶于稀酸、稀堿溶液；其余蛋白為醇溶蛋白，約占蛋白總量的1%～5%。前期研究表明，pH值對(duì)稻米蛋白的溶解性影響顯著，在pH值4.0～7.0的環(huán)境中，稻米谷蛋白的溶解性緩慢增長(zhǎng)，當(dāng)pH值為9.0時(shí)，谷蛋白的溶解性顯著提高。因此，為提高稻米蛋白質(zhì)提取率，前期研究多采用NaOH等堿法提取，該條件下不但容易產(chǎn)生處理成本較高的大量廢水，而且會(huì)誘發(fā)蛋白質(zhì)變性，甚至生成一些有毒性化合物，嚴(yán)重限制了堿法蛋白提取在食品工業(yè)中的應(yīng)用。為溫和獲得糯米大分子蛋白質(zhì)，試驗(yàn)探究以果膠酶破壁為基礎(chǔ)的pH值范圍，對(duì)膠體磨同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解pH值對(duì)同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effect of enzymatic pH value on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein by colloid mill

隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)pH值為4.5時(shí)，蛋白質(zhì)和淀粉的同時(shí)得率最高。已有研究表明，果膠酶的最適酶作用pH值在4.0～5.0范圍內(nèi)［13］，此時(shí)浸泡破壁效率較高，在膠體磨處理過(guò)程中可以釋放出較多的蛋白質(zhì)和淀粉。當(dāng)pH>5.0時(shí)，雖然谷蛋白的溶解性緩慢提高，但是果膠酶的酶活性降低，細(xì)胞間膠質(zhì)的完好性限制了蛋白質(zhì)的提取率，同時(shí)也導(dǎo)致淀粉得率降低。因此選取4.5作為最佳的酶作用pH值。

2.6 酶解溫度的確定

考慮工業(yè)化生產(chǎn)操作適宜性，試驗(yàn)基于以上最優(yōu)條件，選擇40，50，60 ℃研究酶解溫度對(duì)膠體磨同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解溫度對(duì)同時(shí)提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

隨著溫度從40 ℃升溫至50 ℃，蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均呈現(xiàn)顯著升高的變化趨勢(shì)。當(dāng)溫度升至60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均最低。已有研究表明，果膠酶的最適作用溫度為50 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制酶活性［14］，造成蛋白質(zhì)和淀粉溶出效果的降低。糯米開(kāi)始糊化的溫度在60～75 ℃，溫度過(guò)高時(shí)，支鏈淀粉溶脹，黏度增加，進(jìn)一步阻礙蛋白質(zhì)和淀粉的溶出。過(guò)高的溫度不利于提取，因此最佳的酶解溫度為50 ℃。

3 結(jié)語(yǔ)

本文提出酶法輔助膠體磨偶聯(lián)離心處理同時(shí)制備糯米淀粉和蛋白質(zhì)的新工藝，基于果膠酶破壁和水提工藝，最大限度保留產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)。進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)可知，選用果膠酶對(duì)糯米（料液比1：10）進(jìn)行浸泡處理，酶添加量為0.8%，酶解時(shí)間60 min，酶解pH值為4.5，酶解溫度為50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)43.8%，淀粉得率可達(dá)93.2%，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，可為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐和依據(jù)。