高智 徐洪偉 徐宏光 張曉玲 馬明明 徐永明

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA）是老年退變性疾病中最常見的炎癥性疾病之一，發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。研究表明我國(guó)40歲以上人群KOA的發(fā)病率已達(dá)15.6%，KOA引發(fā)的疼痛困擾著約8.1%的國(guó)人[3-4]。KOA的主要病理特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷，它可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、甚至關(guān)節(jié)畸形等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)能力喪失[5-6]。因?yàn)镵OA病因不明，目前尚無特效藥物能夠治療[6]。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6 等細(xì)胞因子直接或間接參與關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)及退變進(jìn)程，并最終引起關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的破壞，導(dǎo)致KOA的發(fā)生[7-8]。NF-κB信號(hào)通路在調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的炎癥中處于主導(dǎo)地位[9-10]。有研究表明，骨保護(hù)素（osteoprotegerin,OPG）在一定程度上能緩解KOA的病情，但其具體作用機(jī)制尚不明確[11-12]。OPG能競(jìng)爭(zhēng)性阻斷NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）與其受體的相互結(jié)合，調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，抑制破骨細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。OPG是否通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路延緩關(guān)節(jié)軟骨的破壞值得進(jìn)一步研究。本研究團(tuán)隊(duì)前期使用FX-5000TM細(xì)胞體外力學(xué)刺激裝置建立模型，對(duì)體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞應(yīng)用不同力學(xué)試驗(yàn)，選取合適的力學(xué)刺激及頻率（在不影響細(xì)胞存活率的情況下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逐漸開始退變）作用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞引起NF-κB信號(hào)通路的激活并使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變[14]。本研究在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究OPG保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的具體作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD成年大鼠8只，7周齡，體重（140±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［SCXK（滬）2014-0002］。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，專用鼠類動(dòng)物飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食復(fù)合型鼠糧，自由飲水，室溫控制在24℃左右，12 h光照12 h黑暗交替。所有操作均符合中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2 試劑和儀器 二型膠原酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：C6885）；胰蛋白酶（美國(guó) Gibco公司，批號(hào)：R001100）；FBS（美國(guó) Gibco 公司，批號(hào)：10099）；DMEM/F12（美國(guó) Hyclone公司，批號(hào)：SH30023.01B）；OPG（美國(guó)Minneapolis公司，批號(hào)：CB35786656）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596026）；Real-Time PCR 試劑盒（中國(guó)TOYOBO公司，批號(hào)：QPK-201）；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒（中國(guó)生工公司，批號(hào)：C50009）；兔抗鼠磷酸化 p65（p-p65）抗體（美國(guó) Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：3036）；兔抗鼠p65抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)：9460）；兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）抗體（美國(guó) Bioworld Technology公司，批號(hào)：BS1231）；山羊抗兔二抗（美國(guó)Bioworld Technology公司，批號(hào)：BS10003）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Invitrogen公司，型號(hào)：countess3）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo＆ Scientific公司，型號(hào)：NanoDrop 2000）；WB 凝膠成像系統(tǒng)（中國(guó) Tanon公司，型號(hào)：T1600）；Real-Time PCR 儀（德國(guó)Roche公司，型號(hào)：Roche LightCycler480）；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本 TaKaRa公司，批號(hào)：6210A-1）；細(xì)胞體外力學(xué)刺激裝置（美國(guó)Flexcell公司，型號(hào)：Flexcell FX-5000TM）；表面附著鼠尾膠原的BioFlexTM6孔多向加力板（美國(guó)Fexcell公司，型號(hào)：BF-4002C）。

1.3 分離培養(yǎng)大鼠原代膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 取8只清潔級(jí)SD大鼠，頸椎脫臼法處死后消毒，于負(fù)壓超凈臺(tái)內(nèi)取出關(guān)節(jié)軟骨，剪碎，胰蛋白酶恒溫震蕩消化30 min，含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，PBS仔細(xì)清洗后加入0.2%二型膠原酶消化，消化期間，每隔約15 min輕輕震蕩培養(yǎng)皿1次，6 h后將培養(yǎng)皿內(nèi)液體倒入70目的濾篩中過濾離心后均勻播種于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代至P2代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將P2代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、間歇性循環(huán)牽張力（intermittent cyclic mechanical tension,ICMT）加力組（ICMT組）、OPG組、ICMT 3 d+OPG組。對(duì)照組：在含10%FBS的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液的BioFlexTM6孔多向加力板上接種培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d；其他各組基礎(chǔ)培養(yǎng)條件均與對(duì)照組相同。ICMT組：將接種后的細(xì)胞放置在細(xì)胞體外力學(xué)刺激裝置內(nèi)，設(shè)置加力參數(shù)：8%壓強(qiáng)的ICMT，0.5 Hz，10 h/d，即0.5 Hz頻率，8%壓強(qiáng)的ICMT對(duì)細(xì)胞每天力學(xué)刺激10 h，對(duì)細(xì)胞加力1 d設(shè)為ICMT 1 d組，加力2 d設(shè)為ICMT 2 d組，加力3 d設(shè)為ICMT 3 d組。OPG組：使用含濃度為5、10、20 ng/ml OPG的細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，根據(jù)OPG濃度設(shè)為5 ng OPG組、10 ng OPG組和20 ng OPG組，培養(yǎng)時(shí)間為3 d。ICMT 3 d+OPG組：在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加力前3 h使用含濃度為5、10、20 ng/ml OPG的細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分別設(shè)為ICMT 3 d+5 ng OPG組、ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組。

1.5 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用甲苯胺藍(lán)染色法。取對(duì)照組、ICMT 3 d組、ICMT 3 d+20 ng OPG組軟骨細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，適量的甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞1 h，晾干后用倒置相差光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。觀察染色前各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及染色后各組細(xì)胞表型的變化。

1.6 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用四噻唑藍(lán)[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl） -2,5-diphenyltetrazolium bromide，MMT]法。將對(duì)照組、ICMT 1 d 組、ICMT 2 d 組、ICMT 3 d組、5 ng OPG組、10 ng OPG組和20 ng OPG組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分別接種在96孔板中培養(yǎng)，各孔加入100 μl MTT并孵育4 h后用DMSO處理細(xì)胞。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔波長(zhǎng)630 nm處吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.7 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中二型膠原、蛋白聚糖、SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白9（SRY-related high-mobility-group box gene 9，SOX-9）、MMP-13 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)采用RT-PCR法。取對(duì)照組、ICMT 1 d組、ICMT 3 d組、ICMT 3 d+5 ng OPG組、ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分別在各細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入1 ml Trizol，充分裂解后，提取RNA，30 μl DEPC水溶解RNA，Nano-Drop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，選取合格樣品（RNA OD260/OD280值為 1.8～2.0）。取 1 μg關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的 RNA，按照20 μl反轉(zhuǎn)體系反轉(zhuǎn)成cDNA，用稀釋10倍的cDNA進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR擴(kuò)增體系量為10 μl[SYBR Premix ExTaqTM(2X)5 μl，ROX Reference Dye（50X）0.2 μl，PCR 上游引物（10 mol/L）0.4 μl，PCR 下游引物（10 mol/L）0.4 μl，稀釋的 cDNA 模板 4 μl]。同一樣品需要設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，點(diǎn)樣混勻放入Real-Time PCR儀中。按照設(shè)定好的程序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸25 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析：95 ℃ 0 s，65 ℃15 s，95 ℃ 0 s）。所得結(jié)果用Real-Time PCR儀自帶軟件Roche LightCycler480 進(jìn)行分析，計(jì)算 2-ΔΔCt值，獲得關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞各基因的表達(dá)情況。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中 MMP-13、p65、p-p65蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取ICMT 3 d組、ICMT 3 d+5 ng OPG組、ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組細(xì)胞，用200 μl蛋白提取裂解液（RIPA）和 2 μl 100×PMSF 加入各孔裂解 30 min后移入EP管中，12 000 r/min離心15 min，留取上清液為軟骨細(xì)胞蛋白；用BCA定量法檢測(cè)各組蛋白濃度。根據(jù)所測(cè)的蛋白濃度，按照20 μg每組的蛋白量，計(jì)算取液量。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%BSA液封閉膜后抗體孵育，洗膜，凝膠成像系統(tǒng)顯影成像并拍照。應(yīng)用Image J軟件分析Western blot條帶灰度值。p65蛋白磷酸化后變成p-p65蛋白代表NF-κB信號(hào)通路的激活，激活后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)MMP-13蛋白的升高。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞受到ICMT 3 d刺激后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，呈鵝卵石樣排布，形態(tài)近似圓形的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞開始出現(xiàn)排布散亂并呈現(xiàn)出偏似于梭形的形態(tài)。染色后可以發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)淡染現(xiàn)象。在ICMT的作用下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生了退變，而用OPG預(yù)處理后的ICMT組細(xì)胞，這種現(xiàn)象得到一定程度的逆轉(zhuǎn)，見圖1（插頁(yè)）。

圖1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)及表型鑒定（a：對(duì)照組；b：ICMT 3 d組；c：ICMT 3 d+20 ng OPG組；倒置相差光學(xué)顯微鏡，×40；d：對(duì)照組；e：ICMT 3 d 組；f：ICMT 3 d+20 ng OPG 組；甲苯胺藍(lán)染色，×40）

2.2 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率比較 ICMT 1 d組、ICMT 2 d組、ICMT 3 d組與對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。5 ng OPG組、10 ng OPG組和20 ng OPG組與對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見圖 3。

圖2 ICMT刺激下各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率比較

圖3 不同濃度OPG作用下各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率比較

2.3 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9、MMP-13 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，ICMT 1 d組、ICMT 3 d組細(xì)胞中二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表達(dá)水平均下降，ICMT 3 d組細(xì)胞中MMP-13 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 4。與 ICMT 3 d組比較，ICMT 3 d+10 ng OPG組細(xì)胞中二型膠原、SOX-9 mRNA表達(dá)水平均升高，ICMT 3 d+20 ng OPG組細(xì)胞中二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表達(dá)水平均升高，ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組細(xì)胞中MMP-13 mRNA表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 5。

圖4 ICMT刺激下各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化

圖5 OPG處理下ICMT刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化

2.4 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-13、p-p65蛋白表達(dá)水平比較 與ICMT 3 d組比較，ICMT 3 d+5 ng OPG 組、ICMT 3 d+10 ng OPG 組、ICMT 3 d+20 ng OPG組MMP-13蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6和表2。與ICMT 3 d組比較，ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組p-p65蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 7和表 2。

圖6 各組細(xì)胞中MMP-13蛋白表達(dá)的電泳圖

表2 各組細(xì)胞中MMP-13和p-p65蛋白表達(dá)水平比較

圖7 各組細(xì)胞中p-p65蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

KOA的病因主要為關(guān)節(jié)軟骨的破壞，不恰當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，進(jìn)而使關(guān)節(jié)軟骨無法緩解運(yùn)動(dòng)過程中的正常力學(xué)刺激，導(dǎo)致關(guān)節(jié)出現(xiàn)功能障礙并引起疼痛[15-16]。目前認(rèn)為，不恰當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激除了對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生直接破壞外，其也會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥因子釋放并使關(guān)節(jié)發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)，逐步引起關(guān)節(jié)的退變[17-19]。

本研究模擬生物膝關(guān)節(jié)力學(xué)產(chǎn)生原理，給體外的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以0.5 Hz，8%壓強(qiáng)的ICMT，通過各種不同的實(shí)驗(yàn)方法，證明了力學(xué)刺激在不引起軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡的前提下，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)自然退變。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞退變的過程中，NF-κB信號(hào)通路起主導(dǎo)作用，NF-κB信號(hào)通路激活后，通過調(diào)控表達(dá)一系列降解酶的產(chǎn)生，分解細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞賴以生存的物質(zhì)，引起細(xì)胞的退變、裂解、壞死，其中MMP-13是NF-κB信號(hào)通路激活后導(dǎo)致細(xì)胞退變的關(guān)鍵性物質(zhì)，其產(chǎn)生的多少與信號(hào)通路的激活程度呈正相關(guān)[20-21]。

OPG作為一種生長(zhǎng)因子受體，在多種細(xì)胞中具有抑制NF-κB信號(hào)通路的能力[13]。目前OPG在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變中的作用機(jī)制缺乏相關(guān)研究，本研究通過力學(xué)的作用模擬出關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外退變的過程發(fā)現(xiàn)，力學(xué)刺激后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路激活，軟骨細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和退變，MMP-13表達(dá)升高，引起細(xì)胞外基質(zhì)二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9的降解，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。而在細(xì)胞受到力學(xué)刺激過程中，應(yīng)用合適濃度的OPG處理細(xì)胞，可觀察到NF-κB信號(hào)通路被抑制，MMP-13表達(dá)降低，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中重要物質(zhì)二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9未隨著力學(xué)刺激發(fā)生明顯降解。

綜上所述，本研究認(rèn)為OPG通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路延緩力學(xué)刺激引起的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變，起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨和膝關(guān)節(jié)的重要作用，在治療膝關(guān)節(jié)炎和預(yù)防膝關(guān)節(jié)退變中具有廣闊的前景。