常晉瑞,魏 明,趙玉峰,南 瑛,曹 健,朱娟霞,孫 娜

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021;*通訊作者,E-mail:563000915@qq.com)

血管鈣化是慢性腎病常見(jiàn)的并發(fā)癥,是慢性腎病全因死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[1,2]。然而,目前尚無(wú)特效的藥物和治療方法能夠減緩或治愈血管鈣化。因此尋找有效的血管鈣化治療方法和干預(yù)靶點(diǎn),具有十分重要的臨床意義。

慢性腎病患者發(fā)生血管鈣化的同時(shí),常伴發(fā)腎源性生物活性物質(zhì)缺乏。研究表明,多種內(nèi)源性生物活性物質(zhì)參與了血管鈣化的調(diào)控[3,4]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)是腎臟分泌的一種糖蛋白,通過(guò)其受體發(fā)揮生物學(xué)活性[5],EPO目前已被廣泛應(yīng)用于臨床腎性貧血的治療。我們前期研究[6]發(fā)現(xiàn),血管平滑肌細(xì)胞上亦有EPO受體(EPO receptor, EPOR)的蛋白表達(dá),且鈣化血管平滑肌細(xì)胞中EPOR蛋白表達(dá)降低,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EPO可減輕慢性腎病大鼠血管鈣化[6]。然而其受體后信號(hào)通路尚不清楚。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7],Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 5, JAK2/STAT5),磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase, PI3K/Akt)與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)是EPOR后的經(jīng)典信號(hào)通路[7]。典型的JAK2/STAT5通路是EPO調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞分化、增殖和存活的重要因子;最近研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT5在多種靶細(xì)胞中參與mRNA剪接、細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞代謝等過(guò)程[7-9];PI3K/Akt信號(hào)在介導(dǎo)紅系祖細(xì)胞存活、增殖和終末分化方面至關(guān)重要,ERK信號(hào)參與了紅細(xì)胞的終末成熟;在非紅系細(xì)胞中,PI3K/Akt和ERK信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥,參與了EPO保護(hù)心肌和神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用[10]。但JAK2/STAT5、PI3K/Akt與ERK信號(hào)通路是否參與EPO減輕血管鈣化的作用尚不清楚。鑒于此,本研究分別采用JAK2/STAT5、PI3K/Akt與ERK信號(hào)通路的阻斷劑AG490、LY294002或PD98059預(yù)孵育大鼠血管平滑肌細(xì)胞,在高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化模型中,觀察3條通路在EPO減輕血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用,探索EPO抑制血管鈣化的受體后通路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性成年SD大鼠,(150±10)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK(陜)2012-003],本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵循西安醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理章程并獲得西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)編號(hào):XYLS2020044]。EPO購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司,β-磷酸甘油(G9422)與茜素紅(A5533)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。AG490(14704)、LY294002(9901)和PD98059(9900)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。鈣含量(C004-2-1)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)(A059-2-2)試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。兔抗平滑肌蛋白(Smoothelin)(ab219652)和兔抗鈣結(jié)合蛋白(Calponin)(ab46794)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。鼠抗骨橋蛋白(osteopontin, OPN)(sc-21742)、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(sc-25778)多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗(山羊抗兔、抗鼠)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京普利萊技術(shù)公司。

1.2 大鼠血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組

按照我們之前的方法[3],采用大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。分離雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈,去除內(nèi)皮和外膜。然后,將血管中膜切成約1 mm2的小塊,置于含有20%胎牛血清(Hyclone,美國(guó))的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM;Gibco,美國(guó)),并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。傳代后,將血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM中。第3代至第8代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

為了分別探索JAK2/STAT5、PI3K/Akt與ERK三條信號(hào)通路在EPO減輕血管鈣化中的作用,將細(xì)胞各分成4組:對(duì)照組、鈣化組、鈣化+EPO組和鈣化+EPO+通路的阻斷劑組(AG490、LY294002或PD98059)。AG490、LY294002與PD98059分別是JAK2/STAT5、PI3K/Akt與ERK通路的阻斷劑。將血管平滑肌細(xì)胞采用2%血清饑餓24 h后,加入AG490(10 μmol/L)或LY294002(10 μmol/L)或PD98059(10 μmol/L)預(yù)孵育30 min,再加入EPO(10 U/ml)并誘導(dǎo)鈣化(10 mmol/L β-甘油磷酸)。每3 d更換一次含有EPO、β-甘油磷酸與AG490、LY294002或PD98059的培養(yǎng)基。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均參照此分組處理。參考文獻(xiàn)[3],在加藥處理第3天收集細(xì)胞進(jìn)行ALP活性測(cè)定,在第6天進(jìn)行蛋白檢驗(yàn)以分析細(xì)胞表型,在第14天進(jìn)行茜素紅染色和鈣含量測(cè)定。

1.3 ALP活性檢測(cè)

培養(yǎng)3 d的待測(cè)細(xì)胞用冷PBS沖洗3次后,加入200 μl ALP裂解液(含0.2% NP40,1 mmol/L MgCl2·6H2O)于冰上裂解30 min后,收取細(xì)胞。將樣品在-70 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次。4 ℃,8 000 r/min離心10 min,取上清。使用ALP試劑盒測(cè)量ALP活性,并將值與蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化,計(jì)算單位蛋白中的ALP活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Smoothelin、Calponin和OPN的蛋白表達(dá)

采用RIPA蛋白裂解液收取細(xì)胞后超聲破碎細(xì)胞,4 ℃ 13 000 r/min離心10 min,取上清。蛋白定量采用BCA試劑盒(西安赫特生物有限公司,批號(hào)WB003)。向上清中加入5×蛋白上樣緩沖液,于100 ℃煮沸15 min。取60 μg樣品蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,白蛋白封閉1 h,一抗稀釋液4 ℃過(guò)夜,二抗常溫孵育1 h后,采用ChemiDoc MP(Bio-Rad公司,美國(guó))成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)顯色曝光后,應(yīng)用Image Lab軟件(Bio-Rad公司,美國(guó))進(jìn)行條帶灰度分析。蛋白相對(duì)含量以目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值表示。

1.5 茜素紅染色檢測(cè)鈣鹽沉積情況

將細(xì)胞用4%(V/V)多聚甲醛固定15 min后,去離子水沖洗3次。加入1%茜素紅1 ml,37 ℃水浴30 min。去離子水沖洗3次。倒盡剩余去離子水。倒置顯微鏡放大100倍觀察、照相。陽(yáng)性染色為橘紅—紅色。染色后的細(xì)胞中加入10%甲酸溶液,于搖床上輕微震蕩孵育10 min,吸取溶解茜素紅的溶液于96孔板,在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度OD值,減去空白孔(10%甲酸)OD值后,與對(duì)照組比較,進(jìn)行半定量分析。

1.6 鈣含量檢測(cè)

培養(yǎng)14 d的待測(cè)細(xì)胞用冷PBS沖洗3次,加入200 μl 0.6 mol/L HCl 4 ℃過(guò)夜使鈣鹽充分溶解后,收取細(xì)胞并超聲破碎細(xì)胞,4 ℃ 13 000 r/min離心10 min,取上清行BCA法蛋白定量。另取上清按照鈣含量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞鈣離子濃度,通過(guò)細(xì)胞蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算單位蛋白中的鈣含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組血管平滑肌細(xì)胞中Smoothelin、Calponin和OPN蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組比較,鈣化組Smoothelin和Calponin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),OPN蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05,見(jiàn)圖1);與鈣化組比較,鈣化+EPO組Smoothelin和Calponin蛋白表達(dá)增高(P<0.01),而OPN蛋白表達(dá)降低(P<0.05,見(jiàn)圖1);與鈣化+EPO組比較,鈣化+EPO+AG490組Smoothelin和Calponin的蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)了53.6%和27.7%(P<0.05),OPN蛋白表達(dá)水平上調(diào)了86.8%(P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與鈣化組比較,#P<0.05,##P<0.01;與鈣化+EPO組比較,&P<0.05,&&P<0.01圖1 Western blot檢測(cè)各組血管平滑肌細(xì)胞中Smoothelin、Calponin和OPN蛋白表達(dá)Figure 1 The protein levels of Smoothelin, Calponin and OPN in vascular smooth muscle cells in each group by Western blot

2.2 AG490對(duì)EPO抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響

與鈣化組相比,鈣化+EPO組鈣含量和ALP活性分別降低了46.7%和49.5%(P<0.01),細(xì)胞間橘紅色鈣鹽染色顯著減少(見(jiàn)圖2)。與鈣化+EPO組比較,鈣化+EPO+AG490組鈣含量和ALP活性分別增加了58.3%(P<0.05)和88.7%(P<0.01),橘紅色鈣鹽染色明顯增加(見(jiàn)圖2)。

2.3 LY294002和PD98059對(duì)EPO減輕血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響

與鈣化組比較,鈣化+EPO組鈣含量和ALP活性明顯降低(P<0.05);與鈣化+EPO組相比,鈣化+EPO+LY294002組或鈣化+EPO+PD98059組鈣含量和ALP活性均無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖3)。

3 討論

一項(xiàng)國(guó)際性、多中心研究發(fā)現(xiàn),81%的慢性腎病患者伴有腹主動(dòng)脈鈣化[11]。血管鈣化是導(dǎo)致慢性腎病患者心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著增加的重要危險(xiǎn)因素[12,13]。因此預(yù)防和早期診治血管鈣化以降低慢性腎病患者心血管事件以及病死率,已成為亟待解決的臨床問(wèn)題。

血管鈣化是指鈣鹽在動(dòng)脈壁的過(guò)度異常沉積。既往認(rèn)為血管鈣化是機(jī)體鈣磷代謝失衡所致的鈣鹽在細(xì)胞和組織間的被動(dòng)沉積過(guò)程,作為與衰老相伴行的退行性病變,是血管老化的標(biāo)志。而近年研究表明[14],血管鈣化的形成是一個(gè)與骨發(fā)育相似的、細(xì)胞介導(dǎo)的、主動(dòng)的、可逆轉(zhuǎn)和高度可調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程,是血管壁細(xì)胞尤其是中膜血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞或軟骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過(guò)程[14]。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變伴隨著收縮蛋白Smoothelin和Calponin等的表達(dá)降低,而成骨細(xì)胞標(biāo)志物蛋白包括ALP、OPN、骨鈣素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2及核結(jié)合因子α1等的表達(dá)增加[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn),高磷刺激的血管平滑肌細(xì)胞中Smoothelin和Calponin的蛋白表達(dá)降低,而ALP活性和OPN蛋白表達(dá)增加,鈣含量和茜素紅染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)高磷處理組鈣鹽沉積陽(yáng)性染色增多,提示離體血管平滑肌細(xì)胞鈣化模型制備成功。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn),多種內(nèi)分泌活性物質(zhì)參與了血管鈣化的調(diào)控[3,4]。腎臟不僅是人體最重要的排泄器官,還是人體一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官。慢性腎病常常同時(shí)并發(fā)血管鈣化、貧血和腎源性生物活性物質(zhì)的缺乏,如EPO。成熟的EPO是一個(gè)高度糖基化、含有165個(gè)氨基酸的糖蛋白,其發(fā)揮作用主要通過(guò)與靶細(xì)胞膜上的EPOR結(jié)合[16]。多篇研究證實(shí),EPO通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡等機(jī)制減輕心、腦血管損傷[17,18],而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡可促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生[19,20]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),EPOR不僅存在于造血細(xì)胞,還存在于血管平滑肌細(xì)胞,而且慢性腎病大鼠鈣化血管平滑肌細(xì)胞中EPOR蛋白表達(dá)降低[5]。在此基礎(chǔ)上,我們探索性地給予鈣化血管平滑肌細(xì)胞EPO處理,發(fā)現(xiàn)EPO能減輕高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變,進(jìn)一步減少鈣鹽沉積,證實(shí)補(bǔ)充生物活性物質(zhì)EPO,可減輕血管鈣化。但本研究尚未觀察給予EPO后,血管平滑肌細(xì)胞中EPOR的表達(dá)改變及EPOR在EPO減輕血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用。在后續(xù)的研究中,我們將直接在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EPOR或采用其他EPOR激動(dòng)劑,進(jìn)一步探索EPO/EPOR在血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用。

多篇研究發(fā)現(xiàn),JAK2/STAT5通路參與了EPO的生物學(xué)作用[7,8]。JAK/STAT通路是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,參與傳遞多種代謝相關(guān)激素和細(xì)胞因子的信號(hào),包括促紅細(xì)胞生成素等[21]。JAK家族有4個(gè)成員:JAK1/2/3和TYK2[22]。JAK1/2和TYK2廣泛表達(dá),而JAK3主要在造血細(xì)胞中表達(dá)。STAT家族有7個(gè)成員STAT1/2/3/4/5a/5b/6。不同的細(xì)胞因子招募不同JAK和STAT相組合。EPO與其受體結(jié)合后,誘導(dǎo)EPOR發(fā)生二聚體化。構(gòu)象變化的EPOR激活下游信號(hào)分子,如JAK2/STAT5、PI3K/Akt、ERK等信號(hào)通路[7,23]。Miljus等[9]在缺氧誘導(dǎo)的蝗蟲(chóng)腦神經(jīng)元損傷模型中發(fā)現(xiàn),JAK2抑制劑AG490可消除EPO對(duì)蝗蟲(chóng)腦神經(jīng)元的保護(hù)作用,而PI3K的抑制劑LY294002對(duì)EPO介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用無(wú)影響[9]。本研究采用AG490預(yù)孵育以阻斷JAK2/STAT5通路后,EPO抑制血管平滑肌鈣化的作用消失,而PI3K/Akt、ERK的阻斷劑LY294002與PD98059不能阻斷EPO減輕血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用。提示EPO抑制血管鈣化是通過(guò)激活JAK2/STAT5通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,JAK2/STAT5信號(hào)通路可能介導(dǎo)了EPO抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變、減少鈣鹽沉積,減輕血管鈣化的作用。內(nèi)源性活性物質(zhì)EPO在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,JAK2/STAT5有可能成為血管鈣化新的防治靶點(diǎn)。