馬亞影，萬蘇艷，姚遠(yuǎn)，趙子歡，董斐，明瑞光，張文萍*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；4.伊利諾伊大學(xué) 厄巴納香檳分校植物生物學(xué)系，美國伊利諾伊州厄巴納 61801）

菠菜（Spinacia oleraceaL.，2n=2x=12）屬于藜科，為一年生或二年生植物，廣泛種植于世界各地，是一種重要且營養(yǎng)豐富的綠葉蔬菜，富含類胡蘿卜素、葉酸、維生素C、鈣和鐵，通常被用作新鮮或烹調(diào)過的肉類和蔬菜的配料［1］。菠菜為雌雄異株植株，其性別決定方式為XY 型，XX為雌株，XY為雄株［2-3］。但研究發(fā)現(xiàn)菠菜的開花系統(tǒng)具有多態(tài)性，某些品種、品系雜交后可以產(chǎn)生既有雄花又有雌花的單個(gè)植物（即雌雄同株異花）［4］，根據(jù)其植株上花的類型將菠菜分為以下4 類：雌株、雄株、雌雄同株異花、雌雄兩性花同株和雄性兩性花同株［3］。研究人員認(rèn)為雌雄同株異花性別受另一個(gè)與X及Y等位的單基因座M控制［4-6］。遺傳分析表明，Y和M分別對(duì)M和X是上位的：XXmm為雌性，XYMM、XYMm 和XYmm為雄性，XXMM 和XXMm 產(chǎn)生雌雄同株異花表型［5-7］。但Onodera 等發(fā)現(xiàn)控制雌雄同株異花的M基因距離微衛(wèi)星標(biāo)記SO4的距離為4.3 cM，而微衛(wèi)星標(biāo)記SO4距離X/Y位點(diǎn)1.6 cM，這表明雌雄同株異花基因與X/Y染色體上性別決定區(qū)域上的基因?qū)Σ皇堑任坏?，是緊密相連的但不是共分離位點(diǎn)［5］。Yamamoto等［7］開發(fā)了其中4個(gè)SCAR 標(biāo)記，這些標(biāo)記與M基因和Y基因都相關(guān)聯(lián)，并且雌雄同株異花基因位于SP_0008和SP_0022標(biāo)記之間，距離為7.1 cM。Takahata 等［2］構(gòu)建了菠菜性染色體46 條蛋白質(zhì)編碼序列的連鎖圖譜，M 基因位于clc?e（SP_0008）和clsy3（SP_0140）位點(diǎn)之間的區(qū)間，雌雄同株異花的基因座位于一個(gè)染色體片段，對(duì)應(yīng)于甜菜9號(hào)染色體上大約1.7 Mb 的區(qū)間，遺傳距離為7.5 cM。

菠菜的基因組較?。ā?89 Mb），但所組裝的基因組包含618 Mb（74.4%）的重復(fù)序列，高于目前報(bào)道的大多數(shù)真核生物基因組［1］。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及測(cè)序成本的降低，全基因組重測(cè)序已成為分子標(biāo)記篩選的重要手段。通過與參考基因組序列比對(duì)，可以找到全基因組內(nèi)大量的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）變異位點(diǎn)。同其它分子標(biāo)記方法相比，SNP標(biāo)記遺傳穩(wěn)定性高、位點(diǎn)分布廣泛且富有代表性，基于SNP 位點(diǎn)可開發(fā)出與表型關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，因此已廣泛被應(yīng)用于分子實(shí)驗(yàn)以及育種研究。主要的技術(shù)手段有：酶切SNP 分型（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPs 和 Derived CAPS，dCAPs）［8］、等位基因特異性PCR（allelespecific PCR，AS-PCR）［9］、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性 PCR （Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）［10］等。KASP 基因分型檢測(cè)是一種基于熒光的檢測(cè)，用于識(shí)別雙等位基因SNP，是新一代的SNP 分型標(biāo)記，已應(yīng)用于多種物種研究［11-14］。

集群分離分析法［15］（又稱混合分組分析法，Bulked Segregant Analysis，BSA），主要是選擇雙親群體分離后代中具有極端表型的個(gè)體進(jìn)行混樣，通過比較不同極端混池之間的多態(tài)性標(biāo)記的差異，從而篩選出與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的定位。近年來隨著測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展與價(jià)格的不斷降低，科研人員將BSA 方法和高通量測(cè)序相結(jié)合，通過比較不同混池間SNP 的頻率差異或者比較混池間純合SNP 的密度的差異，實(shí)現(xiàn)基因的定位［16-17］。

本研究構(gòu)建了雌株與雌雄同株異花性別分離的260 份菠菜F2代分離群體，對(duì)該試驗(yàn)中菠菜父母本以及F2代群體中極端表型的子代池進(jìn)行30×重測(cè)序，經(jīng)BSA-Seq 分析對(duì)控制菠菜雌雄同株異花的基因Monoecious進(jìn)行定位，開發(fā)了與雌雄同株異花基因連鎖的KASP 分子標(biāo)記，為分子輔助育種及菠菜性別調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與性狀調(diào)查

采用中國國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)（https://www. cgris. net/default. asp）收集保存的菠菜Ⅱ9A0073種質(zhì)資源材料，以及源于美國農(nóng)業(yè)部（U.S. DEPARTMENT OF AGRICULTURE，USDA）的菠菜PI604782（SPI 12/79）種質(zhì)資源材料。試驗(yàn)材料種植于福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心五樓511B 人工氣候室（16 h光照，8 h 黑暗）。2018年選?、?A0073種質(zhì)中的雌株作為母本，PI604782種質(zhì)中的雌雄同株異花作為父本，二者雜交獲得F1代植株（約50 株），種植F1代植株并觀察其性別表型，選取其中2 株自交并獲得F2代分離群體。觀察統(tǒng)計(jì)F2代群體的性別表型，并挑選出48 株純合雌株和49 株雌雄同株異花用于混池測(cè)序。

1.2 混池測(cè)序

利用CTAB 法提取菠菜2個(gè)親本以及挑選出的97個(gè)F2代單株的頂端部位幼嫩葉片基因組DNA，分別對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行DNA 濃度測(cè)定并進(jìn)行DNA 等量混池，構(gòu)建純合雌株葉片DNA 子代池和極端雌雄同株異花葉片DNA 子代池。將上述2個(gè)親本和2個(gè)F2子代混合池送貝瑞和康（北京）公司構(gòu)建DNA 文庫并使用Illumina HiSeq 2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE150 雙末端測(cè)序（Paired-end），測(cè)序深度為30×。

1.3 數(shù)據(jù)分析與候選區(qū)間的確定

對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控（Quality Control，QC），并將過濾得到的clean reads 比對(duì)到菠菜Sp75 參考基因組（參考文獻(xiàn)）（http://spinachbase.org/ftp/genome/Sp75/），使 用samtools 工 具［18］和GATK 軟 件 檢 測(cè)SNP［19］。將 檢 測(cè) 得 到 的SNP 首先利用GATK 進(jìn)行粗過濾和篩選，并手動(dòng)進(jìn)一步細(xì)過濾：（1）過濾掉在親本中缺失的位點(diǎn)；（2）過濾低深度的SNP 位點(diǎn)；（3）過濾掉在親本中雜合的位點(diǎn)；（4）過濾親本間基因型一致的位點(diǎn)；（5）過濾子代混池間基因型一致的位點(diǎn)。以BRM（Block Regression Mapping）方法中的AFD 期望值（等位基因頻率差異的期望值，Expected value of allele frequency differency（AF1-AF2））確定控制雌雄同株異花性狀的候選區(qū)間［20］。參考菠菜親本雌株的基因型，計(jì)算雌株子代池與雌雄同株異花子代池的AFD-Expected，最后確定最高峰處為候選區(qū)域。

1.4 KASP 分子標(biāo)記的開發(fā)與遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

將1.3 中得到的候選區(qū)間內(nèi)的SNP 位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為KASP 標(biāo)記，首先在親本中篩選具有基因分型的KASP 標(biāo)記（2個(gè)等位基因特異性正向引物和1個(gè)共同的反向引物以及序列見表2 列出6個(gè)分子標(biāo)記的KASP 引物），之后在F2分離群體中進(jìn)行基因型驗(yàn)證。

KASP 反應(yīng)體系根據(jù)KASP Master Mix 試劑盒（KBS-1016-002）（genecompany.com）進(jìn)行配置（表1），使用Bio-Rad CFX96 touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測(cè)（表2）。

表1 KASP 反應(yīng)體系Table 1 KASP reaction system

表2 KASP 反應(yīng)條件Table 2 KASP reaction conditions

反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)檢測(cè)的2種熒光信號(hào)來判斷樣本分型情況，不同的熒光信號(hào)獲得不同的基因型。統(tǒng)計(jì)F2分離群體中個(gè)體性別表型和基因型，使用Joinmap4.1 軟件（https://www. kyazma. nl/index. php/JoinMap/）構(gòu)建遺傳連鎖圖，作圖算法選回歸算法（regression mapping），作圖函數(shù)選Kosambi 函 數(shù)，使 用R 包LinkageMapView 繪 制 遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜性別表型統(tǒng)計(jì)分析

菠菜Ⅱ9A0073 雌株與PI604782 雌雄同株異花雜交F1代均為雌雄同株異花性狀，F(xiàn)2代雌株與雌雄同株異花性狀分離（圖1）。F2群體共274個(gè)單株，其 中 雌 雄 同 株 異 花205 株，雌 株69 株，χ23∶1=0.004 9＜3.84（P＜0.05），卡 方 概 率P值 等 于0.94。統(tǒng)計(jì)結(jié)果說明F2群體分離比符合3∶1，呈顯著的質(zhì)量性狀分布特點(diǎn)（表3），雌雄同株異花基因?yàn)轱@性基因。

圖1 菠菜親本表型以及F2代分離群體構(gòu)建Fig.1 The phenotype of spinach parents and F2 generation segregating population

表3 雌株Ⅱ9A0073 與雌雄同株異花PI604782 雜交F2群體性別分離比例Table 3 Sex segregation ratio of F2 population between female Ⅱ9A0073 and monoecious PI604782

2.2 菠菜雌雄同株異花基因的BSA 定位

利用BSA-Seq 定位菠菜中雌雄同株異花候選基因，對(duì)2個(gè)親本以及兩個(gè)F2代純合雌株和雌雄同株異花子代混池進(jìn)行重測(cè)序。以2017年發(fā)表的Sp75 基因組為參考基因組，分析重測(cè)序數(shù)據(jù)得到全基因組的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記。以每個(gè)標(biāo)記的等位頻率差值（AFD-Expected）為指標(biāo)，檢測(cè)基因組中與雌雄同株異花性狀關(guān)聯(lián)的位置。結(jié)果顯示，在4號(hào)染色體94.71～103.09 Mb 區(qū)間出現(xiàn)高峰，高峰位置為96.53 Mb，將該位置作為雌雄同株異花基因的主要候選區(qū)間（圖2）。

圖2 F2群體的雌雄同株異花性狀BSA-Seq 分析Fig.2 BSA-Seq analysis of Monoecism in F2 population

2.3 KASP 分子標(biāo)記分析和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

我們?cè)诖菩弁戤惢ɑ颍╔MXM）所在候選區(qū)段選取SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)KASP 分子標(biāo)記（表4），并在親本中進(jìn)行基因型鑒定，共獲得6個(gè)在親本中共分離 的KASP 分 子 標(biāo) 記（SP111，SP151，SP484，SP551，SP566，SP654）。用這6個(gè)KASP 分子標(biāo)記掃描F2代分離群體，并統(tǒng)計(jì)基因型，雌株標(biāo)記基因型記為b（HEX），雌雄同株異花標(biāo)記基因型記為a（FAM），雜合基因型記為h（圖3）。遺傳連鎖分析表明，雌雄同株異花性別基因被定位在標(biāo)記SP111和SP151 之間（圖4），與兩個(gè)標(biāo)記的遺傳距離分別為6.4 cM 和5.4 cM，在Sp75 參考基因組上的物理距離為0.14 Mb（96.29～96.43 Mb），該結(jié)果說明SP111 和SP151 與雌雄同株異花性別基因連鎖。

圖3 KASP 標(biāo)記在雌株和雌雄同株異花菠菜親本及菠菜F2群體中的基因分型結(jié)果Fig.3 Genotyping results of KASP markers in female and monoecious parents and F2 populations of Spinach

圖4 Monoecious 定位區(qū)域遺傳連鎖圖和物理圖Fig.4 Genetic linkage and physical map of Monoecious location region

表4 KASP 標(biāo)記引物信息Table 4 The sequence of KASP markers

2.4 候選區(qū)間的基因功能注釋

結(jié)合Sp75 參考基因組的功能注釋文件，提取4號(hào)染色體96.29～96.43 Mb 區(qū)間內(nèi)11個(gè)候選基因的功能注釋結(jié)果（表5），除去2個(gè)未知功能基因（Spo06505和Spo06508），剩余9個(gè)基因分別編碼不同類型的蛋白。其中Spo06524和Spo06509分別屬于bHLH 和MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，Spo06519屬 于F-box 家 族 成 員，Spo06506屬 于Rer1 家 族 蛋 白，Spo06520和Spo06521均 屬 于 異 黃酮還原酶，Spo06523屬于果膠酯酶，Spo06507編碼腺嘌呤核苷酸α 水解酶樣超家族蛋白，這些基因可能與雌雄同株異花性狀相關(guān)，Spo06505和Spo06508未匹配到同源蛋白，可能為菠菜中的特異基因。

表5 候選區(qū)間內(nèi)的候選基因功能預(yù)測(cè)Table 5 Function prediction of candidate genes in the candidate region

3 討論

菠菜通常被認(rèn)為是雌雄異株物種，早期研究將雄性決定位點(diǎn)Y 定位到最大的染色體上［2-3］，并且利用染色體易位的方法證明了性別決定基因位于染色體的短臂上。劉丹丹等采用SRAP-BSA法篩選到3個(gè)與性別緊密連鎖的SRAP 標(biāo)記，其中2個(gè)標(biāo)記（S5.7、S9.5）與X/Y 共分離，另1個(gè)標(biāo)記與X/Y 基因遺傳距離為0.3 cM［21］。Qian 等［22］構(gòu)建了菠菜的高密度遺傳圖譜，將性別決定基因X/Y 定位于連鎖群LG4 的位置（66.98～69.72 cM 和75.48～92.96 cM），推測(cè)這可能是性別決定基因的理想?yún)^(qū)域。Cai 等［23］在4號(hào)染色體（92～103 Mb）上鑒定了1個(gè)基因組區(qū)域，顯示出菠菜性別類型顯著關(guān)聯(lián)。前期研究人員已經(jīng)構(gòu)建了多個(gè)菠菜性別相關(guān)的遺傳群體，并且開發(fā)了菠菜X/Y 位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記T11A、Spox 用于鑒別菠菜雌雄植株［3，24］。但這些分子標(biāo)記只能對(duì)菠菜雄株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，不能鑒定雌雄同株異花表型的植株。也有研究者開發(fā)與Monoecious連鎖的標(biāo)記［2，5，7］，但該標(biāo)記并不能精確篩選出雌雄同株異花表型的植株。

本研究重新構(gòu)建了菠菜雌雄同株異花基因的F2代分離群體，F(xiàn)2代植株的雌雄同株異花與雌株分離比例約為3∶1（205∶69），進(jìn)一步說明菠菜雌雄同株異花性狀由1 對(duì)顯性基因或主效基因控制，與前人研究結(jié)果相符［4-5］。本研究將Takahata 等［2］構(gòu)建的菠菜性染色體46 條蛋白質(zhì)編碼序列的連鎖圖譜與菠菜物理圖比對(duì)，將Monoecious大致鎖定在95.9～98.9 Mb 區(qū)間內(nèi)。通過BSA 和重測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，以F2分離群體為試驗(yàn)材料，挖掘全基因組的SNP 位點(diǎn)，搜索與雌雄同株異花性狀關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)。初步將Monoecious定位在4號(hào)染色體94.71～103.09 Mb 區(qū)間。

通過KASP 標(biāo)記對(duì)F2代分離群體進(jìn)行基因分型驗(yàn)證，篩選基因分型與表型一致的分子標(biāo)記。由連鎖分析得知，Monoecious與標(biāo)記SP111 和SP151 連鎖，并且這兩個(gè)標(biāo)記基本可以區(qū)分性染色體為XX 背景下的雌株與雌雄同株異花，這加快了對(duì)菠菜性別的鑒定速度。標(biāo)記SP111 和SP151 分別位于菠菜4號(hào)染色體上的96.29 Mb 和96.43 Mb 位置，該區(qū)域長(zhǎng)0.14 Mb 含有11個(gè)基因。其中Spo06519編碼F-box 家族蛋白，F(xiàn)?box基因能夠參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育［25］，擬南芥中的F?box基因AtUFO（Unusual floral orangs），可以調(diào)節(jié)花分生組織和花器官發(fā)育［26］。Spo06509屬于Myb 轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子AtMYB125可以參與雄性生殖細(xì)胞的分化［27］，AtMYB21，AtMYB24和AtMYB57調(diào) 控花藥發(fā)育［28］。Spo06522 蛋白是Sas10 與U3 組成的復(fù)合體，參 與18S rRNA 的產(chǎn)生和小核糖體亞基的組裝，且Sas10 作為染色質(zhì)沉默調(diào)節(jié)劑，即其C 端結(jié)構(gòu)域可能對(duì)其在染色質(zhì)構(gòu)型中的功能很重要。擬南芥中的SAS10/C1D 家族蛋白在核糖體RNA 基因表達(dá)和加工中的雙重作用對(duì)于擬南芥的生殖至關(guān)重要［29-30］。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究開發(fā)出可鑒定菠菜雌株與雌 雄 同 株 的KASP 標(biāo) 記，SP111 和SP151 兩個(gè) 標(biāo) 記為進(jìn)一步精細(xì)定位菠菜雌雄同株異花基因奠定了重要基礎(chǔ)，并且也證明了KASP 分子標(biāo)記有利于開展菠菜基因精細(xì)定位以及圖位克隆等工作。