吳非，劉飛*，張?zhí)O，李棟，孫亮亮，徐進(jìn)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100091）

托魯巴姆（Solanum torvumSw.）是茄子（So?lanum melongenaL.）的近緣野生種，是一種優(yōu)良的茄子砧木和重要的鎘（Cd）低累積作物之一［1］。有研究表明，茄子嫁接到托魯巴姆砧木上后，其果實(shí)中Cd 含量下降了63%～74%［2］。Cd 由根系向莖葉的長距離運(yùn)輸，即Cd 木質(zhì)部裝載量，是托魯巴姆地上部Cd 低累積的關(guān)鍵因素［3］。另外，熒光探針檢測表明，在茄子根中Cd 主要分布在中柱，而在托魯巴姆根中Cd 主要分布于皮層［4］。鎘通過鐵（Fe）、鈣（Ca）和鋅（Zn）轉(zhuǎn)運(yùn)/通道蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞［5］，高濃度Cd 處理后的托魯巴姆轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，ZIP 家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Zinc and iron regulated transporter proteins）基因的差異表達(dá)在托魯巴姆Cd 的低累積發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用［6］，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

ZIP 金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括Zinc regulated transporter proteins（ZRT）和Iron regulated transporter proteins（IRT）［7］，ZIP 家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中廣泛存在，對(duì)Zn2+、Fe2+、Cu2+及Cd2+等多種二價(jià)金屬離子的吸收、分配及運(yùn)輸起重要作用［8-10］。ZIP 蛋白家族成員發(fā)揮功能往往具有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象及專一性，其表達(dá)水平也受到環(huán)境金屬離子濃度的調(diào)控［11］。擬南芥AtIRT1是在根表層細(xì)胞中高度表達(dá)的Fe轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［12］；AtZIP1?5、AtZIP9?12和AtIRT3在擬南芥根和莖中受缺Zn 誘導(dǎo)表達(dá)［13］，并且AtZIP2和AtZIP5也在缺銅（Cu）誘導(dǎo)下于根部表 達(dá)［14］。水 稻OsIRT1和OsIRT2主要在根部表達(dá)，對(duì)Fe2+進(jìn) 行的吸收和運(yùn)輸［15］；缺Zn 脅迫 下，OsZIP2僅在根部表達(dá)，OsZIP7僅在地上部表達(dá)，而OsZIP1、OsZIP3?5和OsZIP8在根和地上部中均表達(dá)［16-19］。研究ZIPs 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同植物中的表達(dá)模式，揭示不同金屬離子脅迫下ZIPs基因在各組織部位中的表達(dá)規(guī)律，可為提高作物養(yǎng)分吸收效率提供新的研究方向［20-21］。本研究利用qRTPCR 方法，分析了托魯巴姆StZIP5/11基因和茄子SmZIP5/11基因在Zn 和Cd 毒害下的表達(dá)模式，測定擬南芥突變體（zip5和zip11）以及轉(zhuǎn)托魯巴姆StZIP5和StZIP11基因擬南芥分別在Zn、Cd 毒害下主根生長量，為初步探明StZIP5和StZIP11基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

托魯巴姆和茄子種子先用無菌水浸泡30 min，無菌環(huán)境下置于50% 消毒水中浸泡消毒8 min，再用無菌水沖洗5～8 遍。將種子均勻的播種在1/2MS 培養(yǎng)基表面。4 ℃中春化3 d 后，放至人工氣候室中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為22 ℃、5000 lx、16 h/8 h 光暗。待子葉完全展開后，選取長勢均勻一致的托魯巴姆和茄子幼苗，轉(zhuǎn)移到1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變。每3 d 更換1次營養(yǎng)液。對(duì)生長4 周的托魯巴姆和茄子幼苗，在營養(yǎng)液中分別進(jìn)行添加200 μmol·L-1Zn或10 μmol·L-1Cd，每處理設(shè)3 組重復(fù)。以正常1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下生長的幼苗為對(duì)照，分別取處理后第1、3 天的葉、莖和根為樣品。樣品收集后立即液氮冷凍并放于-80 ℃保存。

擬南芥突變體zip5（SALK_009007C）和zip11（SALK_009007C）購自TAIR（https://www.arabidopsis.org/）。將托魯巴姆StZIP5和StZIP11基因的CDS 序列分別與含有CaMV 35S 啟動(dòng)子的pCAMBIA1300 載體連接，構(gòu)建StZIP5和StZIP11基因過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株。利用擬南芥花 序 浸 染 法［22］，將構(gòu)建好的StZIP5和StZIP11基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中，并獲得轉(zhuǎn)StZIP5和StZIP11基因的擬南芥StZIP5OX、StZIP11OX、StZIP5OX/zip5、StZIP11OX/zip11、StZIP5OX/zip11和StZIP11OX/zip5后代。將獲得的種子在1/2MS（hyg+）固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；利用qRT-PCR 對(duì)轉(zhuǎn)基因T3代后代進(jìn)行基因表達(dá)鑒定，選擇陽性株系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（表1）。

表1 鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥引物Table 1 Primers for identification of transgenic A.thaliana

1.2 生物信息學(xué)分析

分析所用的托魯巴姆StZIP5和StZIP11的CDS 序列由作者在前期采用RACE 方法克隆得到；茄子、擬南芥的相關(guān)序列信息分別獲取于茄子EGDB（http://eggplant. kazusa. or. jp/）數(shù) 據(jù) 庫［23］和擬南芥TAIR 數(shù)據(jù)庫。采用Clustal Omega 進(jìn)行多序列比較分析，并使用Jalview 進(jìn)行作圖；分子進(jìn)化樹利用MEGA-X 進(jìn)行構(gòu)建，自展值為1000，并使用FigTree 進(jìn)行作圖。

1.3 qRT-PCR

對(duì)收取的托魯巴姆和茄子樣品進(jìn)行總RNA提取，使用Nanodrop 進(jìn)行RNA 樣品純度檢測以及濃度定量，以保證使用的RNA 樣品合格和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。使用Roche LightCycler 480 熒光定量PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR。以Actin8基因作為內(nèi)參，每個(gè)基因3次重復(fù)，使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因表達(dá)分析［24］，顯著性差異t檢驗(yàn)P＜0.05，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primers of qRT-PCR

1.4 根長測定

使用Epson Perfection V500 Photo 掃描儀對(duì)處理4 d 的擬南芥幼苗主根進(jìn)行掃描，并采用Image-J 對(duì)主根生長量進(jìn)行測量。利用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異t 檢驗(yàn)P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列同源性比較分析

對(duì)茄子SmZIPs 以及托魯巴姆StZIP5 和StZIP11 的蛋白序列進(jìn)行了多序列同源性比較分析（圖1）。分析表明托魯巴姆StZIP5 和StZIP11與茄子ZIP 家族成員之間的氨基酸序列具有較高的同源性，預(yù)示了托魯巴姆StZIP5 和StZIP11 與茄子ZIP 家族成員之間具有類似的結(jié)構(gòu)以及發(fā)揮相似或相同的功能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，StZIP5 和SmZIP5 之間的序列一致性為97.97%，StZIP11 和SmZIP11 之間的序列相似度為96.19%（表3）。

表3 StZIP5/11 和SmZIP5/11 序列的相似性百分比單位矩陣Table 3 Percent identity Matrix of sequences in StZIP5/11 and SmZIP5/11

圖1 SmZIPs 的序列同源性分析Fig.1 Sequence identity analysis of SmZIPs

ZIP 蛋白家族之間的進(jìn)化關(guān)系顯示，不同物種之間的同名ZIP 成員具有很高的親緣關(guān)系（圖2），參與分析的ZIP 成員在進(jìn)化上被分為了4個(gè)進(jìn)化分支，ZIP2 和ZIP11 形成的進(jìn)化分支長度最長，ZIP6 形成的進(jìn)化分支個(gè)體成員最少。并且，StZIP5 和SmZIP5 之間的差異度為0.00，StZIP11和SmZIP11 之間的差異度為0.01，表明StZIP5 和SmZIP5 以及StZIP11 和SmZIP11 之間的僅具有極小的序列差異。

圖2 擬南芥、茄子的ZIP 家族成員和托魯巴姆StZIP5 和StZIP11的分子進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic relationship of S.torvum StZIP5 and StZIP11 with other ZIP family members in A.thaliana and S.melon?gena

2.2 鋅毒害對(duì)托魯巴姆和茄子ZIP5 和ZIP11 基因表達(dá)的影響

對(duì)Zn 毒害下托魯巴姆和茄子幼苗ZIP5和ZIP11基因在根、莖、葉中1、3 d 時(shí)表達(dá)水平進(jìn)行了分析（圖3）。StZIP5基因的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組；SmZIP5基因的表達(dá)水平在1 d 時(shí)的根、莖中同樣顯著低于對(duì)照，但在葉中1 d 時(shí)顯著高于對(duì)照；在3 d 時(shí)，根中顯著高于對(duì)照，莖中與對(duì)照組無顯著差異，而葉中顯著低于對(duì)照。StZIP11基因在根中1 d 的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，3 d 時(shí)的表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著差異，SmZIP11基因在根中1 d的表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著差異，3 d 時(shí)的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照；StZIP11基因在莖中的表達(dá)水平較對(duì)照組均無顯著差異，SmZIP11基因顯著高于對(duì)照；StZIP11基因在葉中1 d 的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，3 d 時(shí)的表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著差異，SmZIP11基因在1 d 和3 d 時(shí)均顯著高于對(duì)照。

圖3 鋅毒害下托魯巴姆和茄子ZIP5 和ZIP11 的基因表達(dá)Fig.3 Gene expression of ZIP5 and ZIP11 in S.melongena and S.torvum under high Zn stress

2.3 鎘毒害對(duì)托魯巴姆和茄子ZIP5 和ZIP11 基因表達(dá)的影響

對(duì)Cd 毒害下托魯巴姆和茄子ZIP5和ZIP11基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析（圖4）。托魯巴姆和茄子幼苗Cd 毒害處理1、3 d 時(shí)，StZIP5基因在根中的表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著差異，而SmZIP5基因的表達(dá)水平在3 d 時(shí)顯著高于對(duì)照；StZIP5基因的表達(dá)水平在莖中3 d 時(shí)顯著低于對(duì)照，而SmZIP5基因的表達(dá)水平在1、3 d 時(shí)較對(duì)照組無顯著差異；StZIP5和SmZIP5基因在葉中1 d 的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照，但StZIP5基因3 d 時(shí)于對(duì)照組無顯著差異，SmZIP5基因3 d 時(shí)顯著低于對(duì)照。StZIP11和SmZIP11基因在根、莖、葉中1、3 d 時(shí)的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。

圖4 鎘毒害下托魯巴姆和茄子ZIP5 和ZIP11 的基因表達(dá)Fig.4 Gene expression of ZIP5 and ZIP11 in S.melongena and S.torvum under high Cd stress

2.4 StZIP5 或StZIP11 在擬南芥野生型Col-0、突變體zip5 或zip11 突變體中的異源表達(dá)增加了Zn/Cd 毒害的敏感性

野生型擬南芥Col-0、擬南芥突變體zip5和zip11、轉(zhuǎn)基因擬南芥StZIP5OX、StZIP11OX、StZIP5OX/zip5、StZIP11OX/zip11、StZIP5OX/zip11和StZIP11OX/zip5的主根生長量在45 μmol·L-1Cd 處理下均顯著降低（圖5）。但zip5和zip11的相對(duì)主根長量顯著高于Col-0；StZIP5OX、StZIP11OX的相對(duì)主根長量顯著低于Col-0。StZIP5OX/zip5、StZIP11OX/zip5的相對(duì)主根長量顯著低于zip5；StZIP5OX/zip11、StZIP11OX/zip11的相對(duì)主根長量顯著低于zip11。

圖5 Cd 毒害下擬南芥的主根生長量和相對(duì)主根生長量Fig.5 Principal root growth and relative principal root growth of A.thaliana under high Cd stress

400 μmol·L-1Zn 處理下，擬南芥的主根生長量和相對(duì)主根生長量結(jié)果如圖6所示。Col-0、zip5、zip11、StZIP5OX、StZIP11OX、StZIP5OX/zip5、StZIP11OX/zip11、StZIP5OX/zip11和StZIP11OX/zip5的主根生長量在400 μmol·L-1Zn 處理下同樣被顯著抑制。并且，zip5、zip11的相對(duì)主根長量顯著高于Col-0；StZIP5OX、StZIP11OX的相對(duì)主根長量顯著低于Col-0；StZIP5OX/zip5、StZIP11OX/zip5的相對(duì)主根長量顯著低于zip5；StZIP5OX/zip11、StZIP11OX/zip11的 相 對(duì) 主 根長量顯著低于zip11。

圖6 Zn 毒害下擬南芥的主根生長量和相對(duì)主根生長量Fig.6 Principal root growth and relative principal root growth of A.thaliana under high Zn stress

3 討論

本研究中，茄子SmZIPs以及托魯巴姆StZIP5和StZIP11的蛋白序列同源性比較分析結(jié)果表明，茄子ZIP家族蛋白成員之間在功能結(jié)構(gòu)區(qū)的氨基酸序列相對(duì)保守，與蒲琦［11］、傅明輝等［25］論述的對(duì)植物ZIP基因家族結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)結(jié)果一致。StZIP5和SmZIP5 之間的序列一致性為97.97%，StZIP11和SmZIP11 之間的序列一致性為96.19%。分子進(jìn)化樹顯示，托魯巴姆StZIP5、StZIP11 和茄子SmZIPs 與擬南芥同名ZIP 家族成員具有較高的親緣關(guān)系。并且StZIP5 和SmZIP5 之間的差異度為0.00，StZIP11 和SmZIP11 之間的差異度為0.01，這些結(jié)果說明StZIP5 和SmZIP5 以及StZIP11 和SmZIP11 之間的僅具有極小的序列差異。

在200 μmol·L-1Zn 處理下，除StZIP11基因在葉中1 d 時(shí)的表達(dá)水平顯著升高（3 d 時(shí)較對(duì)照組無顯著差異）外，其余時(shí)間點(diǎn)StZIP5和StZIP11基因的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低或無顯著差異。推測在Zn 毒害下，托魯巴姆通過降低StZIP5和StZIP11基因的表達(dá)量來減少StZIP5 和StZIP11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量，從而降低對(duì)Zn 的吸收以維持植物 體Zn的平衡。Lee 等［26］在Zn毒害下通過水稻OsZIP5基因表達(dá)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。茄子在200 μmol·L-1Zn 處 理3 d 時(shí)，SmZIP5和SmZIP11基因在根中顯著高表達(dá)，暗示茄子在Zn 毒害過程中吸收了較多的Zn。而在葉中，SmZIP5和SmZIP11基因在應(yīng)對(duì)Zn 毒害時(shí)表達(dá)水平先升高后降低，推測在茄子葉中先通過增加轉(zhuǎn)運(yùn)分配，后通過降低表達(dá)量的方式以減少過量Zn 對(duì)葉的毒害作用。與Katarzyna 等［27］認(rèn)為煙草NtZIP11基因在維持整個(gè)煙草鋅的供應(yīng)相符。

Cd 對(duì)植物的毒害作用主要是由于Cd 與Fe、Zn之間的競爭吸收，Cd通過Fe或Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道進(jìn)入植物細(xì)胞，從而導(dǎo)致植物缺Fe或缺Zn［5］。10 μmol·L-1Cd 處理下，托魯巴姆StZIP5和StZIP11基因和茄子SmZIP5和SmZIP11基因在根、莖和葉中的qRT-PCR 結(jié)果表明，ZIP5和ZIP11基因參與了托魯巴姆和茄子對(duì)Cd 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。 托魯巴姆StZIP11基因和茄子SmZIP11基因在1、3 d 時(shí)較對(duì)照組均顯著高表達(dá)，但根中StZIP5基因在1、3 d 時(shí)較對(duì)照組均無顯著，而茄子SmZIP5基因在3 d 時(shí)的根中顯著高表達(dá)。這表明，相對(duì)托魯巴姆，茄子在Cd 毒害過程中吸收了更多的Cd。在莖中StZIP5基因和SmZIP5基因的表達(dá)水平均較低，但托魯巴姆StZIP5在3 d 時(shí)較對(duì)照組顯著低表達(dá)。在葉中1 d 時(shí)StZIP5基因和SmZIP5基因的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著高表達(dá)。以上結(jié)果表明，茄子可能通過根部吸收大量Cd，并且通過莖向地上部運(yùn)輸，使Cd 在葉中富集。Mori等［3］通過對(duì)托魯巴姆和茄子根部、地上部以及木質(zhì)部汁液中Cd 的濃度測定結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。與茄子不同，托魯巴姆莖和葉中StZIP5基因表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著差異或顯著低表達(dá)；與Mori等［3］認(rèn)為莖的截留作用是導(dǎo)致了托魯巴姆地上部Cd 低累積相符。然而托魯巴姆莖部對(duì)Cd 的具體截留機(jī)制還有待進(jìn)一步揭示。

Cd 和Zn 毒害均能顯著抑制植物根系生長［28-29］。在45 μmol·L-1Cd 和400 μmol·L-1Zn 處 理下，野生型擬南芥Col-0、擬南芥突變體zip5和zip11、轉(zhuǎn)托魯巴姆StZIP5和StZIP11基因擬南芥StZIP5OX、StZIP11OX、StZIP5OX/zip5、StZIP11 OX/zip11、StZIP5OX/zip11和StZIP11OX/zip5的主根生長均受到不同程度的抑制，與Castiglione等［28］得出的Zn 毒害能顯著抑制植物根系生長一致。擬南芥AtZIP5或AtZIP11基因的功能喪失突變體（zip5和zip11）主根生長表現(xiàn)出了對(duì)Zn 和Cd脅迫顯著的耐受性；托魯巴姆StZIP5或StZIP11基因在擬南芥野生型Col-0 中的過量表達(dá)顯著加重了Zn 和Cd 毒害下對(duì)擬南芥主根生長的抑制；托魯巴姆StZIP5或StZIP11基因在擬南芥突變體zip5或zip11中的過量表達(dá)也顯著加重Zn 和Cd 毒害對(duì)擬南芥主根生長的抑制。這些結(jié)果表明，托魯巴姆StZIP5或StZIP11基因在擬南芥中的過量表達(dá)增強(qiáng)了Zn 和Cd 毒害對(duì)擬南芥主根生長的抑制作用。

4 結(jié)論

托魯巴姆作為一種優(yōu)良的茄子砧木和重要的Cd 低累積作物之一，其Cd 低累積機(jī)理的研究對(duì)茄子、番茄等低Cd 蔬菜品種的改良具有極其重要的意義。本研究結(jié)果表明StZIP5或StZIP11參與了托魯巴姆低Cd 累積過程，有助于未來進(jìn)一步的研究探明StZIP5或StZIP11在托魯巴姆中調(diào)節(jié)Cd 累積與耐受的分子機(jī)理。