徐心怡，楊欣,2，梁國(guó)強(qiáng),3，朱惠萍，黃雪，王愛(ài)民，孫宏文

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215007；2.蘇州科技城醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 蘇州 215000；3.蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215007)

反流性食管炎(RE)是指由胃和十二指腸內(nèi)容物反流入食管,而引起食管黏膜破損的慢性難治性消化系統(tǒng)疾病[1]。RE臨床上表現(xiàn)為反酸、燒心、胸骨后灼痛等癥狀,內(nèi)鏡下表現(xiàn)為食管黏膜破損(即糜爛、潰瘍等)是診斷RE的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。RE是胃食管反流病(GERD)的一種重要亞型,RE患者約占GERD患者的40%[3]。根據(jù)流行病學(xué)資料顯示,隨著人們生活方式、飲食習(xí)慣的改變,我國(guó)RE發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[4],現(xiàn)多數(shù)學(xué)者認(rèn)為抗反流防御機(jī)制減弱與反流刺激因素增強(qiáng)是RE發(fā)病的主要原因[5]。食管黏膜屏障作為抗反流防御機(jī)制的重要組成部分,直接參與抵抗胃及十二指腸反流物的刺激。若該抗反流屏障被破壞,會(huì)導(dǎo)致食管對(duì)反流物的防御能力不足,繼而引發(fā)RE,因此,治療RE可從維持食管黏膜結(jié)構(gòu)的完整性著手。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療RE首選質(zhì)子泵抑制劑(PPI),雖然短期療效尚可,但易產(chǎn)生不良反應(yīng)及耐藥性和依賴性,復(fù)發(fā)率也較高[6]。為提高黏膜愈合率,臨床上常聯(lián)合胃黏膜保護(hù)劑協(xié)同治療RE,但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生腹脹、腹瀉、便秘等胃腸道反應(yīng)[7]。

祖國(guó)醫(yī)藥在治療RE方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首屆國(guó)醫(yī)大師徐景藩教授針對(duì)RE食管黏膜損傷的修復(fù)率先提出“祛瘀護(hù)膜”法,并且受上消化道鋇餐檢查的啟示,總結(jié)出“三七-白及糊劑臥位服藥法”。在臨床上,此法治療食管賁門疾病和消化道潰瘍、出血等疾病皆有良效[8-9]。Souza等[10]認(rèn)為當(dāng)食管上皮細(xì)胞受到反流物刺激后,可分泌釋放促炎因子,從而誘導(dǎo)上皮增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),最終損傷食管黏膜。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)/天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)信號(hào)通路在誘導(dǎo)促炎因子成熟釋放的過(guò)程中起到了重要調(diào)控作用,已成為各種炎癥性疾病治療的靶點(diǎn)[11]。本研究在建立大鼠RE模型的基礎(chǔ)上,探討祛瘀護(hù)膜劑通過(guò)調(diào)控NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路以修復(fù)食管黏膜來(lái)治療RE的相關(guān)機(jī)制,為祛瘀護(hù)膜劑臨床推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性大鼠64只,體質(zhì)量(200±20) g,由蘇州希諾賽生物科技有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0006,飼養(yǎng)于蘇州市中醫(yī)醫(yī)院研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,12 h光照/黑暗循環(huán),室溫控制在20～24 ℃,相對(duì)濕度45%～70%,分籠、自由飲用水飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批件號(hào):2020倫研批033。

1.2 藥物與試劑

三七粉(產(chǎn)地:云南,批號(hào):190918)和白及粉(產(chǎn)地:貴州,批號(hào):190907)購(gòu)自蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥房;周氏藕粉(桂林周氏順發(fā)食品有限公司)和淀粉(海寧楓園食品有限公司)購(gòu)自超市;鋁鎂加混懸液(安達(dá),15 mL∶1.5 g,批號(hào):B190928,揚(yáng)州一洋制藥有限公司)。Caspase-1、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒(貨號(hào):BYE21034、BYE20024、BYE20063,上海邦奕生物科技有限公司);NLRP3抗體、β-actin抗體(貨號(hào):Ab263899、Ab8227,Abcam公司);Caspase-1抗體(貨號(hào):GTX14367,Gene Tex公司);羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(貨號(hào):A0208,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司,型號(hào):Infinite F50);洗板機(jī)(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司,型號(hào):RT-3500);離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司,型號(hào):Sorvall ST 40);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):Mini protean 3 cell);電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Hoefer公司,型號(hào):TE77XP);酶標(biāo)儀(芬蘭Nearbymro公司,型號(hào):MK3);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào):Tanon-5200)。

1.4 造模方法

將64只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)取出12只作為空白組。其余52只大鼠應(yīng)用“4.2 mm幽門夾+2/3胃底結(jié)扎術(shù)”進(jìn)行RE造模[12]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,術(shù)前24 h禁食不禁水,手術(shù)當(dāng)日大鼠腹腔注射4%水合氯醛(3 mL·kg-1)進(jìn)行麻醉,麻醉成功后以仰臥位置于鼠板,以彈性布帶固定四肢,充分暴露胸腹部。寬3.0 mm的雙扁鐵心扎線(夾心金屬直徑0.3 mm)在4.2 mm直徑的圓柱體上纏繞成幽門夾,高壓滅菌后備用。于劍突下腹前部2.0 cm×3.0 cm區(qū)域備皮,0.5%碘伏消毒術(shù)野皮膚,鋪無(wú)菌洞巾。手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌要求,沿上腹部正中線開(kāi)腹,于幽門十二指腸交界處避開(kāi)血管,套上幽門夾后血管鉗夾緊。使用3-0線系住幽門夾閉合端,另一端結(jié)扎2/3胃底,限制幽門夾向遠(yuǎn)端移位。檢查胃及十二指腸等部位無(wú)出血后,腹腔注入慶大霉素(2萬(wàn)U)及0.5%甲硝唑1 mL。用5-0線連續(xù)縫合腹膜,3-0線間斷縫合肌肉及皮膚。傷口對(duì)皮,75%酒精消毒。術(shù)后待大鼠清醒,予以自由飲用5%葡萄糖溶液,禁食24 h后恢復(fù)常規(guī)飲食。術(shù)后每日按1.5 mg·kg-1向腹腔內(nèi)注入鹽酸左氧氟沙星注射液以預(yù)防感染,共給藥3 d。造模第7天隨機(jī)選取空白組大鼠和造模大鼠各2只,處死后采集食管組織,石蠟包埋,HE染色,光鏡下觀察食管黏膜是否完整、有無(wú)糜爛、潰瘍、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況,判斷造模是否成功。造模成功后,除10只空白組大鼠外,另外50只造模大鼠隨機(jī)分為模型組,西藥組,祛瘀護(hù)膜劑低、中、高劑量組,每組10只。

1.5 分組給藥

造模成功當(dāng)天開(kāi)始給藥,18 g淀粉+100 mL蒸餾水調(diào)勻后文火加熱并攪拌直至成半流質(zhì)薄糊狀，空白組及模型組予以灌胃。臨床上采用三七粉3 g和白及粉3 g,加入藕粉20 g,用100 mL蒸餾水充分調(diào)勻后,文火加熱,攪拌直至成半流質(zhì)薄糊狀，制成祛瘀護(hù)膜劑。根據(jù)人鼠體表面積法換算[13],大鼠的等效劑量為0.54 g·kg-1,設(shè)為低劑量組,隨后分別擴(kuò)大3倍、9倍,設(shè)為中劑量、高劑量組,故低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.54、1.62、4.86 g·kg-1。分別用三七粉、白及粉各2.7、8.1、24.3 g，加入20 g藕粉，用100 mL蒸餾水充分調(diào)勻后，文火加熱，攪拌直至成半流質(zhì)薄糊狀，制成低、中、高劑量祛瘀護(hù)膜劑，生藥(三七粉+白及粉)含量分別為54、162、486 g·L-1。西藥組予安達(dá)(鋁鎂加混懸液)灌胃,給藥劑量為135 mg·kg-1。各組灌胃體積均為10 mL·kg-1。每日給藥1次,連續(xù)給藥14 d,其間稱取大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材

取材前一晚禁食不禁水,當(dāng)天麻醉后,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血3 mL,2 500 r·min-1離心10 min后取血清分裝,保存于-80 ℃冰箱備用;取出食管組織4～8 cm,肉眼觀察食管黏膜組織形態(tài)變化,看有無(wú)擴(kuò)張、穿孔及黏膜表面有無(wú)糜爛、潰瘍等,并沿食管縱軸切開(kāi),取食管組織2 cm標(biāo)本2塊,1塊投入10%福爾馬林溶液固定,制備常規(guī)石蠟切片,另1塊置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 觀察指標(biāo)與方法

1.7.1 大鼠一般情況的觀察 監(jiān)測(cè)并記錄大鼠造模后存活率,大鼠活動(dòng)、飲食、排便等一般情況和體質(zhì)量等生理指標(biāo)。

1.7.2 觀察食管形態(tài)學(xué)變化[2]肉眼觀察RE大鼠食管黏膜破損、融合情況;將“1.6”中病理組織切片,用HE染色后在光鏡下觀察食管組織病理學(xué)變化,并進(jìn)行RE病理分級(jí),正常為0分,輕度(點(diǎn)狀或條狀發(fā)紅、糜爛)為1分,中度(發(fā)紅、糜爛,融合<75%)為2分,重度(廣泛發(fā)紅、糜爛,或有潰瘍,融合≥75%)為3分。

1.7.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平 將“1.6”中RE大鼠血清置于4 ℃冰箱中解凍后,以ELISA試劑盒檢測(cè)血清Caspase-1、IL-1β、IL-18含量,取出試劑盒室溫平衡20 min后,除空白孔外,在標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔中加入100 μL檢測(cè)抗體,封板孵育1 h;棄液，吸水紙拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,重復(fù)此步驟,加入100 μL顯色底物,避光孵育15 min,加入50 μL終止液混勻,15 min之內(nèi)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

1.7.4 Western blot法檢測(cè)大鼠食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)量 冰上將食管組織剪碎,添加RIPA組織細(xì)胞快速裂解液,裂解后離心15 min,收集上清液,進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。參照BCA試劑盒測(cè)蛋白總濃度,制備分離膠和濃縮膠,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離及轉(zhuǎn)膜反應(yīng),加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,加入稀釋后的一抗NLRP3(1∶1 000)和Caspase-1(1∶1 000),室溫孵育2 h,用TBST洗膜后,再加入相應(yīng)二抗(1∶1 000),與膜37 ℃孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè),最后于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況以及體質(zhì)量的觀察

造模前各組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異(P>0.05),造模后空白組大鼠一般情況同前,體質(zhì)量在給藥第7、14天較第1天顯著升高(P<0.01)。而模型組大鼠進(jìn)食量減少,性情抑郁、少動(dòng)、排便量減少。給藥第6天和第10天,模型組和祛瘀護(hù)膜劑高劑量組分別死亡1只大鼠(經(jīng)解剖分析其死亡均由于灌胃操作不當(dāng)造成)。在給藥第14天,模型組與空白組相比體質(zhì)量明顯下降(P<0.01),祛瘀護(hù)膜劑各劑量組、西藥組與模型組比較,進(jìn)食情況、行為狀態(tài)有所改善,第14天體質(zhì)量明顯增加(P<0.05,P<0.01)。大鼠體質(zhì)量變化詳見(jiàn)圖1。

注:與d1比較,$$P<0.01;與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較Fig.1 Comparison of body mass changes in each group

2.2 大鼠食管形態(tài)學(xué)的變化

肉眼可見(jiàn):空白組大鼠食管黏膜光滑。模型組大鼠食管黏膜粗糙發(fā)紅,黏膜糜爛部分融合為潰瘍。西藥組食管黏膜較為光滑平整,未見(jiàn)潰瘍、糜爛等病變。祛瘀護(hù)膜劑低劑量組大鼠食管黏膜略有粗糙,有條狀發(fā)紅糜爛,融合范圍不大。祛瘀護(hù)膜劑中劑量組大鼠食管黏膜有點(diǎn)狀發(fā)紅糜爛,無(wú)融合現(xiàn)象。祛瘀護(hù)膜劑高劑量組大鼠的食管黏膜層結(jié)構(gòu)分明,未見(jiàn)糜爛性潰瘍及增生白斑。

光鏡下病理可見(jiàn):空白組大鼠食管黏膜在光鏡下未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠食管黏膜可見(jiàn)炎癥表現(xiàn),如鱗狀上皮黏膜固有層的乳頭變長(zhǎng)、水腫,黏膜糜爛或潰瘍形成,少數(shù)有柱狀上皮化生;西藥組可見(jiàn)鱗狀上皮細(xì)胞略水腫,黏膜層內(nèi)部分炎癥浸潤(rùn),糜爛、潰瘍等病理較少出現(xiàn);祛瘀護(hù)膜劑低劑量組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞輕度破壞黏膜上皮,部分肌層厚度增加;祛瘀護(hù)膜劑中劑量組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞部分破壞黏膜上皮,黏膜下局部水腫;而祛瘀護(hù)膜劑高劑量組黏膜未見(jiàn)明顯改變,未見(jiàn)糜爛、潰瘍等病變。鏡下病理圖片見(jiàn)圖2。各組大鼠光鏡下食管黏膜病理組織學(xué)評(píng)分見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠病理組織學(xué)切片(HE,×100)Fig.2 Comparison of histopathological sections in each group (HE,×100)

注:與空白組比較,***P<0.001;與模型組比較,圖3 各組大鼠光鏡下食管黏膜病理組織學(xué)評(píng)分比較Fig.3 Comparison of esophageal mucosal pathological histological scores under photocopy in each group

2.3 大鼠血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較

模型組血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平較空白組顯著升高(P<0.001),西藥組,祛瘀護(hù)膜劑中、高劑量組血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平較模型組顯著下降(P<0.001)。與西藥組比較，祛瘀護(hù)膜劑高劑量組血清Caspase-1水平顯著下降(P<0.001)；與祛瘀護(hù)膜劑低劑量組比較，祛瘀護(hù)膜劑中、高劑量組血清Caspase-1、IL-18水平顯著下降(P<0.001),祛瘀護(hù)膜劑中劑量組血清IL-1β水平明顯下降(P<0.01)；與祛瘀護(hù)膜劑中劑量組比較，祛瘀護(hù)膜劑高劑量組血清Caspase-1水平顯著下降(P<0.001)。見(jiàn)圖4。

注:與空白組比較,***P<0.001;與模型組比較,#P<0.05,###P<0.001;與西藥組比較,$P<0.05,$$P<0.01,$$$P<0.001;與祛瘀護(hù)膜劑低劑量組比較,△△P<0.01,△△△P<0.001;與祛瘀護(hù)膜劑中劑量組比較,圖4 各組大鼠血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平比較Fig.4 Comparison of serum Caspase-1, IL-1β and IL-18 levels in each group

2.4 大鼠食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)情況

與空白組比較，模型組食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，西藥組、祛瘀護(hù)膜劑各劑量組食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.001)。與西藥組比較，祛瘀護(hù)膜劑高劑量組食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。祛瘀護(hù)膜劑高劑量組食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)量較祛瘀護(hù)膜劑低、中劑量組顯著下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見(jiàn)圖5。

注:與空白組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001;與西藥組比較,$$P<0.01;與祛瘀護(hù)膜劑低劑量組比較,△△P<0.01,△△△P<0.001;與祛瘀護(hù)膜劑中劑量組比較,☆P<0.05,☆☆☆P<圖5 各組大鼠食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of protein expressions of NLRP3 and Caspase-1 in esophageal tissues in each group

3 討論

古代醫(yī)學(xué)中沒(méi)有關(guān)于RE的記載,但根據(jù)其病因、發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn),可將該病歸屬于“吐酸”“吞酸”“嘈雜”“胸痞”“食管癉”等范疇[14]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病病位在食管與胃,和脾、肝、膽均有密切聯(lián)系,基本病機(jī)為胃氣上逆。根據(jù)RE病程長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率高以及在疾病發(fā)展過(guò)程中食管黏膜血流量逐漸下降而損傷食管上皮的特點(diǎn)[15],符合葉天士《臨證指南醫(yī)案》[16]中“久病血瘀”“百日久恙,血絡(luò)必傷”“血虛絡(luò)澀”“營(yíng)虛成痹”的記載。因此,吳門醫(yī)派醫(yī)家認(rèn)為血瘀是本病的重要病理因素,應(yīng)治以活血祛瘀,使“血無(wú)凝滯,氣血宣通”,則食管黏膜破潰自愈。首屆國(guó)醫(yī)大師、吳門醫(yī)派大家徐景藩教授積累多年臨床經(jīng)驗(yàn),將本病分為氣郁證、痰氣交阻證、肝胃郁熱證、氣滯血瘀證四型論治,且在臨證治療時(shí)針對(duì)RE食管黏膜損傷的修復(fù)方面,首創(chuàng)“祛瘀護(hù)膜”法,運(yùn)用“外治法內(nèi)服”理論,總結(jié)出“三七-白及糊劑臥位服藥法”,即將三七粉、白及粉與適量藕粉調(diào)成糊劑,囑患者睡前臥位服用,配合糊劑的黏性,使得藥物附著在糜爛、潰瘍表面以便充分吸收,護(hù)膜作用更強(qiáng)[8]。其中三七止血散瘀、消腫定痛,白及收斂止血、消腫生肌,三七、白及合用具有化瘀斂瘍、護(hù)膜生肌,促進(jìn)糜爛潰瘍病灶愈合的作用[17]。藕粉性黏,作為賦形劑,也有益血止血、調(diào)中護(hù)膜之功?！队耖彼幗狻吩?“三七和營(yíng)止血,通脈行瘀,行瘀血而斂新血”[18]。三七的有效提取成分三七總皂苷(PNS)能夠抑制血小板聚集,抗血栓形成,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)生長(zhǎng)、修復(fù)鎮(zhèn)痛等作用[19]。PNS可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的活化,降低Caspase-1、IL-1β、IL-18水平,改善機(jī)體炎癥損傷狀態(tài)[20]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白及多糖(BSP)作為白及的主要化學(xué)成分,可通過(guò)下調(diào)Caspase-8表達(dá),抑制炎癥因子IL-1β等的異常分泌,增強(qiáng)機(jī)體的免疫抗炎功能,促進(jìn)受損黏膜組織細(xì)胞的修復(fù),且能改善黏膜血流量,發(fā)揮保護(hù)黏膜的作用,可以顯著降低潰瘍的復(fù)發(fā)率[21-22]。諸藥合用,無(wú)寒熱之弊,有護(hù)膜生肌之功,使化腐生新之力協(xié)同增效。

炎性小體作為一種高分子量蛋白復(fù)合體,觸發(fā)人體相關(guān)炎癥應(yīng)答機(jī)制[23]。在目前發(fā)現(xiàn)的炎性小體中,NLRP3炎性小體最具有代表性,其由NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣銜接蛋白(ASC)和Caspase-1效應(yīng)蛋白組成,可誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子的成熟、釋放而引起炎性反應(yīng),參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[24]。ASC用以連接上游的NLRP3和下游的Caspase-1,從而激活NLRP3炎性復(fù)合體[25]。當(dāng)NLRP3被激活后,可以使Caspase-1前體裂解為有活性的Caspase-1,從而起始或執(zhí)行細(xì)胞程序,將IL前體進(jìn)行分解剪切,產(chǎn)生相應(yīng)成熟的炎癥細(xì)胞因子,誘導(dǎo)炎癥發(fā)生和細(xì)胞死亡,加重食管炎癥反應(yīng)[26-27]。研究結(jié)果表明,在發(fā)炎的巴雷特食管活檢標(biāo)本中可發(fā)現(xiàn)IL-1β處于高表達(dá)水平,而降低其水平可使炎癥癥狀改善及鏡下黏膜損傷減輕[28]。Yin等[29]用酸性膽鹽刺激人食管上皮細(xì)胞HET-1A來(lái)模擬食管上皮的混合反流損傷,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通降顆粒含藥血清可通過(guò)下調(diào)NLRP3表達(dá)阻止炎性小體的組裝激活,從而拮抗Caspase-1活化,抑制促炎因子IL-1β和IL-18的成熟、分泌。Nadatani等[27]發(fā)現(xiàn)使用脂多糖(LPS)孵育巴雷特食管上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路的激活,啟動(dòng)NLRP3炎性小體,催化IL-1β及IL-18前體的蛋白裂解、成熟。此外,LPS可促進(jìn)線粒體來(lái)源活性氧(mtROS)的產(chǎn)生,從而激活NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路,觸發(fā)促炎因子的釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是由Caspase-1介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡,正常的焦亡可保護(hù)組織器官免受微生物感染及內(nèi)源性損害,而過(guò)度的激活則會(huì)引起細(xì)胞膜的迅速破裂,釋放IL-1β和IL-18等炎癥因子,引起強(qiáng)烈的病理性炎癥反應(yīng)[30]。

綜上,給予祛瘀護(hù)膜劑治療后的RE模型大鼠一般情況較前改善、體質(zhì)量明顯增加,食管黏膜病理性損傷減輕,并且有一定的劑量依賴性,其中高劑量祛瘀護(hù)膜劑干預(yù)作用最為顯著,食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)量及血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平均較模型組顯著下降(P<0.001),且食管組織形態(tài)與空白組差別不大。由此可見(jiàn),祛瘀護(hù)膜劑能夠抑制NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路的過(guò)度激活,下調(diào)大鼠食管組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá),降低大鼠血清Caspase-1、IL-1β、IL-18水平。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路與食管炎癥的相關(guān)性,提示祛瘀護(hù)膜劑可以有效改善食管上皮損傷進(jìn)而修復(fù)食管黏膜,促進(jìn)大鼠RE的愈合,其對(duì)食管炎癥的拮抗作用是通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。