張衛(wèi)中，馬素娜，張小靜

(1.博愛縣磨頭鎮(zhèn)衛(wèi)生院，河南 博愛 454450；2.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院病毒性疾病基礎(chǔ)理論研究實驗室，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

銀屑病是一種慢性、反復復發(fā)的常見皮膚炎癥性疾病，是伴隨角化細胞過度增殖等現(xiàn)象的鱗屑丘疹性皮膚病，誘發(fā)因素復雜多樣[1]。銀屑病全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為0.1%～3%，不同國家的發(fā)病率差異較大。發(fā)達國家發(fā)病率相對較高，為2%～3%；我國的發(fā)病率低于發(fā)達國家，為0.4%～2%[2-3]。銀屑病是長期性疾病，目前暫無根治的方法和藥物。近年來，從血論治銀屑病成為中醫(yī)藥治療銀屑病的新思路。人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT)的增殖、凋亡和炎癥反應與銀屑病的發(fā)生發(fā)展密不可分[4-5]。白細胞介素(IL)-22是一種細胞因子，主要是由T細胞轉(zhuǎn)化后形成的Th17細胞產(chǎn)生，與角質(zhì)形成細胞的生長和分化密切相關(guān)，在銀屑病的發(fā)病中有重要作用，可引起銀屑病患者皮膚紅斑。莪術(shù)醇是莪術(shù)的主要有效成分，具有抗病毒、抗癌、抗菌的作用。莪術(shù)醇或中藥復方中加入莪術(shù)可有效抑制銀屑病皮膚損害，其或可作為治療藥物的重要組成成分[6]。本研究探討了莪術(shù)醇對HaCaT活力、細胞周期、細胞凋亡及STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

注射用甲氨蝶呤(MTX)，上海信誼藥廠有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號121D045，5 mg/支。莪術(shù)醇，購自上海艾匯生物科技有限公司，產(chǎn)品批號CC110546；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，產(chǎn)品批號依次是1982146，2041879；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)研究所，批號依次是C0009M-3，C1067M-2；STAT3抗體和p-STAT3抗體，購自美國promage公司，產(chǎn)品批號依次是ab68153、ab267373。BD FACSAria Ⅲ型流式細胞儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；IX70型熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

HaCaT細胞購自中國科學院上海細胞庫。將HaCaT細胞用含體積分數(shù)100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃，每2～3 天換新培養(yǎng)基1次，細胞融合至80%左右時進行消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 檢測指標

1.3.1 細胞增殖情況

將HaCaT細胞加入質(zhì)量分數(shù)分別為 1.25，2.5，5，10，20，40，80 mg/L的莪術(shù)醇中培養(yǎng)；另將HaCaT細胞加入質(zhì)量分數(shù)分別為12.5，25，50，100，200 μg/L的IL-22中培養(yǎng)；此外，將HaCaT加入IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 10 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 20 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 40 mg/L、IL-22 100 μg/L和MTX 5 μg/mL中培養(yǎng)。空白對照組不做任何處理。以MTT試劑盒檢測，在各組細胞培養(yǎng)至24，48，72 h時分別加入5 g/L的MTT溶液50 μL，在37 ℃下，孵育4 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜后振蕩反應15 min，用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復3次，取平均值。

1.3.2 細胞凋亡情況

將空白對照組、IL-22 100 μg/L組、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 10 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 20 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 40 mg/L、IL-22 100 μg/L和MTX 5 mg/L組細胞培養(yǎng)48 h，用不含EDTA的胰酶消化，離心，收集細胞，PBS漂洗2次，加500 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞。取1.0×106個細胞，PBS清洗后，加入100 μL結(jié)合緩沖液，輕輕吹打混懸細胞；分別加入25 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，渦旋混合均勻，室溫避光孵育10 min；最后加入400 μL結(jié)合緩沖液，混合均勻；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，Q3象限記作細胞早期凋亡率、Q2記作細胞晚期凋亡率。每組3個平行，重復3次。

1.3.3 HaCaT細胞上清培養(yǎng)液中IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量

將空白對照組、IL-22 100 μg/L組、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 10 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 20 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪術(shù)醇 40 mg/L、IL-22 100 μg/L和MTX 5 mg/L組細胞培養(yǎng)24 h，收集各組細胞上清培養(yǎng)液，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α和VEGF的含量。實驗終止反應后，根據(jù)測定A450 mm吸光度。每組3個平行，重復3次。

1.3.4 STAT3和p-STAT3蛋白表達

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測。蛋白樣品SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，一抗STAT3抗體和p-STAT3抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后辣根過氧化物酶標記二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入顯影混合液顯影。以β-actin為內(nèi)參，應用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值。每組3個平行，重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量分數(shù)的莪術(shù)醇對HaCaT細胞增殖率的影響

MTT檢測顯示：與空白對照組對比，24 h時，僅有莪術(shù)醇2.5 mg/L組HaCaT細胞增殖率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其他劑量組的增殖率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。48 h時，莪術(shù)醇2.5 mg/L組HaCaT細胞增殖增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。72 h時，莪術(shù)醇20，40，80 mg/L組的增殖率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組24，48，72 h HaCaT細胞增殖率對比

2.2 不同質(zhì)量分數(shù)的IL-22對HaCaT細胞增殖率的影響

與空白對照組對比，IL-22 50，100，200 μg/L組24 h和IL-22 100，200 μg/L組48 h時，HaCaT細胞增殖率增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IL-22 25，50，100，200 μg/L組72 h時，HaCaT細胞增殖率增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組24，48，72 h HaCaT細胞增殖率對比

2.3 不同質(zhì)量分數(shù)的莪術(shù)醇對IL-22誘導的HaCaT細胞增殖率的影響

與空白對照組對比，24，48，72 h時，IL-22 100 μg/L組HaCaT細胞增殖率增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與IL-22 100 μg/L組對比，加20，40 mg/L莪術(shù)醇和MTX 5 mg/L組在48，72 h時的HaCaT細胞增殖率均降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組24，48，72 h HaCaT細胞增殖率對比

2.4 不同質(zhì)量分數(shù)的莪術(shù)醇對HaCaT細胞凋亡的影響

與空白對照組對比，IL-22 100 μg/L組HaCaT細胞早期、晚期凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與IL-22 100 μg/L組對比，加20，40 mg/L莪術(shù)醇和MTX 5 mg/L組的HaCaT細胞早期、晚期凋亡率增高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并有一定劑量依賴性。見表4。

表4 各組HaCaT細胞早期、晚期凋亡率對比

2.5 不同質(zhì)量分數(shù)的莪術(shù)醇對IL-22誘導的HaCaT細胞上清培養(yǎng)液中TNF-α、VEGF和IL-6含量的影響

與空白對照組對比，IL-22 100 μg/L組HaCaT細胞上清培養(yǎng)液中TNF-α、VEGF和IL-6的含量降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與IL-22 100 μg/L組對比，加20，40 mg/L莪術(shù)醇和MTX 5 mg/L組的HaCaT細胞上清培養(yǎng)液中的TNF-α、VEGF和IL-6含量增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組TNF-α、VEGF和IL-6含量對比

2.6 不同質(zhì)量分數(shù)的莪術(shù)醇對IL-22誘導的HaCaT STAT3和p-STAT3蛋白的影響

與空白對照組對比，IL-22 100 μg/L組HaCaT細胞中p-STAT3蛋白表達降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與IL-22 100 μg/L組對比，加入10，20，40 mg/L莪術(shù)醇和MTX 5 mg/L組的HaCaT細胞的p-STAT3蛋白表達水平增高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而STAT3蛋白表達較之差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表6。

表6 各組 STAT3和p-STAT3蛋白表達水平對

3 討 論

銀屑病的組織病理改變包括角質(zhì)形成細胞分化程度較低、過度增殖及炎癥反應等，臨床表現(xiàn)為鱗屑脫落、紅斑、瘙癢及繼發(fā)感染，常見發(fā)病區(qū)域為頭皮和四肢[6-7]。表皮的角質(zhì)形成細胞經(jīng)歷1個細胞周期(分裂、分化成熟、脫落)需要28 d左右，但銀屑病患者表皮細胞完成一個周期只需約5.5 d，由此說明角質(zhì)形成細胞增殖分化成熟周期與銀屑病的進展相關(guān)[8]。因此，本實驗通過檢測角質(zhì)形成細胞的增殖活性、細胞凋亡率來模擬和研究銀屑病細胞損傷。

莪術(shù)具有廣泛的臨床應用，主要作用是行氣解郁、破瘀、止痛。研究結(jié)果顯示，莪術(shù)參與細胞的增殖、遷移、分化、凋亡、自噬、炎癥等過程，可作為治療銀屑病的外用藥[9]。莪術(shù)醇是莪術(shù)的有效成分之一，其是否參與抑制銀屑病進展目前尚不完全清楚。研究表明，莪術(shù)醇具有抗菌、抗炎和抗腫瘤的作用，具有良好的應用前景和開發(fā)空間[10-11]。本實驗以角質(zhì)形成細胞為研究對象，研究莪術(shù)醇對角質(zhì)形成細胞活性、凋亡的影響，以及可能的調(diào)控機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能夠抑制角質(zhì)形成細胞活性；20,100 mg/L 莪術(shù)醇處理的細胞早期、晚期凋亡率比正常培養(yǎng)細胞增加。

角質(zhì)形成細胞增殖、分化、凋亡受到多種信號分子和信號通路間接或直接的調(diào)控，如STAT3信號通路[12]。STAT3信號轉(zhuǎn)導途徑影響多種信號分子向細胞核的信號傳遞，并且廣泛參與各種細胞存活、細胞周期和凋亡等生物學特性[13-14]。STAT3參與細胞的分化和胚胎細胞發(fā)育等過程，并具有重要的調(diào)控作用，在腫瘤細胞中參與細胞過度增殖、血管生成、細胞轉(zhuǎn)移和免疫逃避等生物學特性的調(diào)控[15-16]。研究表明，在銀屑病患者體內(nèi)通過激活STAT3信號通路可引起細胞過度增殖，從而導致銀屑病表皮細胞生長周期時間縮短[17]。STAT3信號通路在銀屑病患者體內(nèi)可能通過增加磷酸化STAT3的表達量，從而導致細胞免疫功能異常[18]。因此，本實驗為了探究莪術(shù)醇的可能作用機制，采用莪術(shù)醇處理角質(zhì)形成細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能顯著降低p-STAT3蛋白的表達，表明莪術(shù)醇可能通過調(diào)控STAT3通路參與角質(zhì)形成細胞增殖和細胞凋亡。此可能是治療銀屑病的重要調(diào)控機制。綜上所述，莪術(shù)醇降低角質(zhì)形成細胞過度增殖的能力和誘導細胞凋亡，可能與角質(zhì)形成中STAT3信號通路有密切關(guān)系。