吳軍，覃俊凱，黃華武

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 百色 533000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種常見的臨床綜合征，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有3%～18%住院患者出現(xiàn)AKI，并導(dǎo)致住院死亡率的提升[1]。AKI的特點(diǎn)是腎功能急劇下降，體內(nèi)液體和代謝廢物的積累及電解質(zhì)失衡，并可進(jìn)展至慢性腎病和終末期腎病。研究顯示，腎臟對(duì)缺血缺氧高度敏感，腎缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是導(dǎo)致內(nèi)源性AKI主要原因[2]。腎IRI的病理表現(xiàn)包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥等，但主要病理改變是發(fā)生在腎近端小管上皮細(xì)胞(tubular epithelial cells ，TECs)，它對(duì)缺血非常敏感，主要表現(xiàn)為細(xì)胞極性喪失、刷狀邊界損傷、細(xì)胞-細(xì)胞黏附破壞，引發(fā)細(xì)胞死亡[3-4]。到目前為止，由于腎IRI引起AKI的機(jī)制未完全明確，且沒(méi)有有效的藥物來(lái)治療AKI[5]。以往研究認(rèn)為，在AKI病理微環(huán)境下，依賴半胱天冬酶(caspase)的細(xì)胞凋亡(apoptosis)是程序性細(xì)胞死亡的唯一形式，然而越來(lái)越多的證據(jù)表明調(diào)控細(xì)胞壞死已成為可能，其中壞死性凋亡(necroptosis)和鐵壞死(ferroptosis)成為近年研究熱點(diǎn)[6-7]。necroptosis結(jié)合了壞死與凋亡的特征，在AKI的發(fā)展中起著重要作用，ferroptosis，一種以鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物積累為特征的調(diào)控性壞死，也是腎TECs細(xì)胞死亡的主要模式[8-9]。本研究通過(guò)建立腎IRI模型，探索參與腎IRI的細(xì)胞壞死形式，從而為改善AKI患者的治療策略鋪平道路。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑 體重400～500 g的24只雄性Wistar大鼠，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度25°、12 h光照/黑暗交替、45%濕度的環(huán)境中，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有大鼠術(shù)前禁食8 h，自由飲水。標(biāo)記熒光素抗體的HRP、MLKL 兔多克隆抗體購(gòu)自Bioworld公司(Catalog：BS7639)，GPX4兔多克隆抗體購(gòu)自Bioworld公司(Catalog：BS7323)，混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)兔多克隆抗體購(gòu)自Bioworld公司(Catalog：BS7639)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4) 兔多克隆抗體購(gòu)自Bioworld公司(Catalog：BS7323)，總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(貨號(hào)S0107)，脂質(zhì)氧化丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(貨號(hào)S0131)。

1.2 腎IRI模型建立 將大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，包括正常組(NC組，n=6)、假手術(shù)組(Sham組，n=6)、腎缺血組(RI組，n=6)和腎缺血再灌注組(RIR組，n=6)，NC組不做處理，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于鼠臺(tái)上，縱行切開皮膚，分離脂肪暴露雙腎及腎蒂，Sham組開腹后游離雙腎，RI組分離腎動(dòng)脈并用動(dòng)脈夾鉗夾，觀察腎臟由鮮紅色變?yōu)榘底仙?，?jì)時(shí)30 min后松開動(dòng)脈夾，同時(shí)收集以上3組血清和腎組織。RIR腎臟恢復(fù)為鮮紅色表明再灌注成功(180 min)，再灌注180 min后收集血清和腎組織。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 各組分別經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取5 ml血液，低速4 ℃離心取上清，根據(jù)總SOD活性檢測(cè)試劑盒和MDA檢測(cè)試劑盒操作指示檢測(cè)血清中SOD、MDA。

1.4 免疫組化病理切片 腎臟縱行切開，福爾馬林固定石蠟包埋的組織，切片厚3～4 μm，經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷、滴加抗體、顯色、襯染、封片等操作，在顯微鏡下觀察MLKL/GPX4蛋白表達(dá)情況。

1.5 TUNEL法檢測(cè)腎細(xì)胞死亡 采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)每組腎細(xì)胞凋亡情況，具體步驟按TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。在顯微鏡下觀察每張切片約200個(gè)細(xì)胞死亡情況并拍照。

1.6 腎組織MLKL/GPX4蛋白 采用Western blot檢測(cè)，取腎組織進(jìn)行總蛋白抽提，將提取的蛋白溶液與5×上樣buffer按5∶1比例混合均勻，煮沸5 min，待冷卻，配置電泳膠，膠凝后用1×電泳緩沖液清洗膠孔上樣，80 V恒壓電泳50 min，120 V恒壓電泳，至溴酚藍(lán)剛出膠底部時(shí)停止電泳等，最后將膜放至暗盒顯影。

2 結(jié)果

2.1 血清抗氧化指標(biāo) 與NC組比較，RI、RIR兩組中的SOD活力均明顯下降(P<0.05)，且RIR下降更為明顯，見圖1A；RIR組的MAD含量明顯上升(P<0.05)，見圖1B。

A：血液中SOD活力；B：血液中MDA含量。NC代表正常組；Sham代表假手術(shù)組；RI代表缺血組；RIR代表缺血再灌注損傷組。與NC組相比，*表示P<0.05。

2.2 TUNEL法檢測(cè)腎細(xì)胞壞死結(jié)果 RI組、RIR組的腎細(xì)胞死亡數(shù)明顯增多，TUNEL法顯示RIR組中可以觀察到部分細(xì)胞發(fā)生腫脹、變圓甚至出現(xiàn)凋亡小體，見圖2A；RIR組中細(xì)胞死亡數(shù)量明顯上升(P<0.05)，柱狀圖細(xì)胞死亡比率與之相符合，見圖2B。

A：TUNEL法檢測(cè)各組大鼠腎臟細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)，標(biāo)尺為50 μm；B：對(duì)應(yīng)柱狀圖顯示各組小鼠細(xì)胞死亡比率。NC代表正常組；Sham代表假手術(shù)組；RI代表缺血組；RIR代表缺血再灌注組。與NC組相比，*表示P<0.05。

2.3 Western blot檢測(cè)腎臟組織中MLKL、GPX4蛋白的表達(dá)結(jié)果 RIR組腎臟組織中MLKL蛋白的表達(dá)較其他3組顯著升高，見圖3A、圖3B；RI組、RIR組GPX4蛋白的表達(dá)顯著降低，與NC組及sham組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3C、圖3D，RIR下降更明顯。

2.4 免疫組化

2.4.1 MLKL蛋白免疫組化結(jié)果 免疫組化病理切片顯示MLKL蛋白在RIR中棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(尤其是箭頭所指的腎小管上皮細(xì)胞，見圖4A)，說(shuō)明MLKL蛋白表達(dá)在RI/RIR中顯著上升(P<0.05)，見圖4B。

A、C為MLKL、GPX4蛋白與各自內(nèi)參GAPDH的Western blot檢測(cè)代表性蛋白條帶圖片；B、D為定量分析的MLKL、GPX4蛋白表達(dá)水平。與NC組相比，*表示P<0.05。

A：免疫組化病理切片顯示各組大鼠腎細(xì)胞中MLKL蛋白的表達(dá)，箭頭所指為腎小管上皮細(xì)胞，與其他各組相比，RIR組中含MLKL蛋白的陽(yáng)性棕黃色細(xì)胞數(shù)顯增加，標(biāo)尺為50 μm。B：顯示各組小鼠腎臟切片MLKL蛋白占比的數(shù)據(jù)柱狀統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果與A一致。NC代表正常組；Sham代表假手術(shù)組；RI代表缺血組；RIR代表缺血再灌注組。與NC組相比，*表示P<0.05。

2.4.2 GPX4蛋白免疫組化結(jié)果 GPX4免疫組化病理切片顯示，與其他各組相比，RIR組GPX4蛋白表達(dá)區(qū)域占比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

3 討論

AKI是一種以短期腎功能突然下降，引起血肌酐上升和水電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂，導(dǎo)致全身各個(gè)系統(tǒng)發(fā)生障礙的臨床綜合征。非重癥住院患者患AKI的死亡率甚至高達(dá)10%～20%[10]。導(dǎo)致AKI的原因有多種，包括腎灌注不足、休克或敗血癥引起的腎缺血再灌注損傷，而腎缺血-再灌注損傷是導(dǎo)致內(nèi)源性AKI主要原因[2]。線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥也可促成AKI的發(fā)生，但主要病理改變是發(fā)生在TECs，它對(duì)缺血非常敏感，主要表現(xiàn)為細(xì)胞極性喪失、刷狀邊界損傷、細(xì)胞-細(xì)胞黏附破壞，引發(fā)細(xì)胞死亡[3-4]。necroptosis的發(fā)現(xiàn)使調(diào)控細(xì)胞壞死成為可能，從而對(duì)AKI的未來(lái)治療產(chǎn)生潛在的影響[11-12]。有相當(dāng)多的證據(jù)表明，necroptosis是一種與壞死形態(tài)相似的程序性細(xì)胞死亡，在AKI和腎纖維化的發(fā)展中起著重要作用[13]。此外，最近的證據(jù)表明，ferroptosis，一種以鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化物積累為特征的調(diào)控性壞死，可能是腎TECs細(xì)胞死亡的主要模式[7，9]。隨著對(duì)細(xì)胞死亡形式的研究，多種細(xì)胞死亡途徑被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)AKI中所發(fā)生的細(xì)胞壞死形式的研究尚不全面，本文旨在通過(guò)建立腎IRI模型，研究參與由腎IRI導(dǎo)致AKI的細(xì)胞壞死形式。

A：免疫組化病理切片顯示各組大鼠腎細(xì)胞中GPX4蛋白的表達(dá)，與其他各組相比，RIR組含GPX4蛋白細(xì)胞數(shù)明顯減少，標(biāo)尺為50 μm。B：顯示各組小鼠腎臟切片GPX4蛋白表達(dá)區(qū)域占比，結(jié)果與A一致。NC代表正常組；Sham代表假手術(shù)組；RI代表缺血組；RIR代表缺血再灌注組。與NC組相比，*表示P<0.05。

本研究中通過(guò)TUNEL檢測(cè)，觀察到在NC組和Sham組中基本未出現(xiàn)腎細(xì)胞死亡而在RI組及RIR組中細(xì)胞死亡數(shù)量明顯上升，腫脹、變圓細(xì)胞數(shù)增多，而在RIR組中細(xì)胞死亡更為明顯，有些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生染色質(zhì)濃縮、邊緣化、核膜裂解等明顯細(xì)胞死亡形態(tài)。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增多表明RIR模型建立成功。

Necroptosis是一種不同于細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞死亡方式，最早由Degterev A等[14]通過(guò)對(duì)大腦缺血性損傷研究中所注意到的。當(dāng)發(fā)生necroptosis時(shí)，配體與死亡受體結(jié)合，各種下游分子被有序招募[15]。所啟動(dòng)的下游通路作用于受體反應(yīng)蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)和3(RIP-K3)，其磷酸化后形成壞死小體(necrosome)[15-16]。壞死小體磷酸化MLKL，磷酸化的MLKL隨之經(jīng)歷寡聚反應(yīng)與質(zhì)膜中的磷脂酰肌醇磷酸鹽結(jié)合導(dǎo)致膜穿孔，繼而發(fā)生necroptosis[17-20]。此外激活的MLKL也被招募到線粒體膜上，導(dǎo)致線粒體功能障礙[21]。所以可以把磷酸化的MLKL看作為necroptosis的執(zhí)行者，通過(guò)檢測(cè)MLKL的水平可以反映出是否發(fā)生了necroptosis，免疫組化結(jié)果顯示MLKL蛋白在NC組、Sham組、RI組中未見明顯的棕黃色陽(yáng)性的細(xì)胞，而在RIR組中棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著上升，這說(shuō)明在RIR模型中有necroptosis的參與。在大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生necroptosis的同時(shí)也伴隨著活性氧(ROS)的生成，ROS大量產(chǎn)生超過(guò)機(jī)體的清除能力使體內(nèi)抗氧化活性被消耗，ROS激增合并線粒體過(guò)氧化，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放毒性蛋白到胞質(zhì)中，引起DNA鏈損傷，對(duì)于necroptosis就產(chǎn)生了一個(gè)前饋效應(yīng)，ROS已被證明在包括腎I/R損傷等多種情況下會(huì)觸發(fā)壞死性凋亡[22-24]。血液SOD活力的高低反應(yīng)了細(xì)胞的抗氧化能力，MDA的含量則反應(yīng)出細(xì)胞膜過(guò)氧化程度，他們都可以作為氧化損傷程度的標(biāo)志，下一步，隨著研究的進(jìn)行，我們將進(jìn)一步增加對(duì)ROS及其他指標(biāo)的檢測(cè)。在圖1中，與其他各組相比，RIR組中的SOD活力明顯降低，MDA的含量明顯升高。除necroptosis發(fā)生了氧化應(yīng)激，ferroptosis的發(fā)生也依賴于ROS，由于I/R損傷也誘導(dǎo)了大量ROS的產(chǎn)生[25]，因此鐵死亡可能也參與了腎I/R損傷的發(fā)病機(jī)制[26-27]，此外，在指部死亡組織研究中，有明顯的ROS上升及GPX4水平的下降，也暗示存在ferroptosis的激活[28]。RIR模型中總抗氧化能力SOD的下降以及氧化指標(biāo)MDA的上升都為上述兩種細(xì)胞死亡形式的發(fā)生提供了依據(jù)。

Ferroptosis是一種新型調(diào)控細(xì)胞死亡途徑，最早是由Dixon SJ等[29]發(fā)現(xiàn)的，其特征是依賴鐵反應(yīng)的脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。谷胱甘肽(GSH)是一種天然抗氧化劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激影響，GSH和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)一起，通過(guò)催化過(guò)氧化氫生成氧和水來(lái)消除過(guò)氧化氫[30]。在哺乳動(dòng)物中，存在8種GPX，而在這之中只有GPX4具有催化過(guò)氧化氫脂質(zhì)的功能，使其成為GSH抗氧化作用的核心調(diào)控酶[31]。在正常情況下，GPX4可以通過(guò)還原磷脂氫過(guò)氧化物來(lái)阻止脂質(zhì)的氧化，若表達(dá)減少或降低都可發(fā)生ferroptosis，它充當(dāng)了鐵死亡守門人的角色，可以作為判斷鐵死亡的主要指標(biāo)[32]。因此，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了各組大鼠中的GPX4，發(fā)現(xiàn)在RIR中GPX4蛋白表達(dá)對(duì)比NC、Sham、RI 3組中的GPX4蛋白表達(dá)明顯下降，差異有顯著性；免疫組化的結(jié)果也與Western blot檢測(cè)結(jié)果相符。這反映出在RIR中有ferroptosis參與。

綜上所述，本研究通過(guò)建立大鼠RIR模型，通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及RIPK3、GPX4的研究，確定了IR引起的細(xì)胞死亡不僅是凋亡，還有necroptosis和ferroptosis。兩種細(xì)胞死亡伴隨著ROS的產(chǎn)生，而ROS也可進(jìn)一步推動(dòng)兩種細(xì)胞死亡的進(jìn)程，同時(shí)鈣離子參與了necroptosis和ferroptosis發(fā)生過(guò)程也有報(bào)道，盡管necroptosis和ferroptosis的下游調(diào)控方式存在相通之處，但對(duì)于這兩種死亡方式的機(jī)制并未研究透徹，一個(gè)疾病的發(fā)生發(fā)展，往往是多種通路共同調(diào)控的，進(jìn)一步探究AKI中細(xì)胞死亡機(jī)制將為AKI的治療奠定扎實(shí)基礎(chǔ)。