覃春，徐佳音，王雪，管愛(ài)星，廖麗娟，黃永毅，黃贊松

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院耐藥微生物感染防治研究中心，廣西 百色 533000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種可定植于人胃黏膜上皮細(xì)胞的革蘭陰性、微需氧螺旋桿菌，是導(dǎo)致胃部疾病輕、中、重疾病的主要原因[1]。世界超過(guò)50%的人口胃內(nèi)定植有H.pylori，美國(guó)將H.pylori明確歸為致癌物。治療并根除H.pylori已成為治療消化性潰瘍及預(yù)防胃癌發(fā)生的重要手段。由于抗生素的廣泛使用引起的細(xì)菌耐藥，導(dǎo)致H.pylori的根除率逐年下降，耐藥率隨之上升，發(fā)掘新的抗H.pylori藥物非常必要[2]。隨著中藥的不斷發(fā)掘，其抗菌作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。烏藥[Linderaaggregata(Sims)Kosterm]屬樟科植物，其干燥后的塊根是常用的行氣止痛藥物，可治療胸腹脹痛、產(chǎn)后腹痛、寒氣郁滯、痛經(jīng)、頭痛、尿頻、遺尿等癥狀。烏藥中主要含有揮發(fā)油、異喹啉生物堿、呋喃倍半萜及其內(nèi)酯、黃酮類等成分。異烏藥內(nèi)酯，又名異烏藥醚內(nèi)酯，屬于烏藥主要成分中呋喃倍半萜內(nèi)酯化合物的一種[3]。研究顯示，異烏藥內(nèi)酯在卵巢癌、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤中具有抑制其增殖、轉(zhuǎn)移或促進(jìn)凋亡的作用[4-7]。近幾年，其抗炎作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝損傷或小鼠炎癥模型中均發(fā)現(xiàn)其抗炎作用[8-10]。另有研究表明異烏藥內(nèi)酯在肝臟糖代謝中也起到關(guān)鍵作用[11]。但異烏藥內(nèi)酯在抗菌方面鮮有研究，特別是對(duì)H.pylori的抗菌作用很少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究針對(duì)異烏藥內(nèi)酯對(duì)H.pylori及非H.pylori菌株的抑制作用展開研究，篩選其抗菌譜，以期探究其抗菌作用，并為后期研發(fā)先導(dǎo)藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 異烏藥內(nèi)酯(CAS號(hào)：957-66-4)購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，BactoTM Brain Heart infusion(BHI)培養(yǎng)基、哥倫Columbia blood Agar base(G)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)小牛血清均購(gòu)于南京晶格化學(xué)科技有限公司，H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株(26695、NSH57、MSD132、G27)由南京醫(yī)科大學(xué)畢洪凱實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，H.pylori臨床分離菌株(HPBS001-HPBS016)為本實(shí)驗(yàn)室分離獲得。非Hp菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、白色念珠菌、新生隱球菌、奇異變形桿菌、熱帶假絲酵母、空腸彎曲菌、枯草芽孢桿菌、摩氏摩根菌、溶血葡萄球菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、醋桿菌、大腸桿菌、彎曲乳桿菌、釀酒酵母、脆弱擬桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、霍氏腸桿菌均購(gòu)自廣東微生物保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)譜分析 化合物異烏藥內(nèi)酯質(zhì)譜分析由成都瑞芬思公司完成。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 使用含10%小牛血清的哥倫比亞固體培養(yǎng)基或腦心浸液培養(yǎng)基，于37 ℃、5%O2、10% CO2培養(yǎng)箱或搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 微量稀釋法檢測(cè)異烏藥內(nèi)酯對(duì)H.pylori菌株最小抑菌濃度(MIC) ①藥物制備：配置異烏藥內(nèi)酯濃度為4 mg/ml。②菌液準(zhǔn)備：將對(duì)數(shù)期H.pylori菌液調(diào)整濃度OD600為0.3(1.0×108CFU/ml)，稀釋至1.0×107CFU/ml，備用。③96孔板制備：以96孔板A1～A12孔作為藥物濃度最高孔，加入173.6 μl培養(yǎng)基及6.4 μl上述藥物，余下7孔均加入90 μl培養(yǎng)基，從上至下對(duì)倍稀釋至第8孔，使藥物濃度從1～8孔濃度分別為128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml。設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照孔、藥物陰性孔、細(xì)菌陽(yáng)性孔。④接種菌液：取上述備用菌液10 μl加至第1～8孔和陽(yáng)性孔中(工作濃度為1×106CFU/ml)，陰性孔不加菌對(duì)照。⑤結(jié)果判讀：以培養(yǎng)基空白對(duì)照孔、藥物陰性孔無(wú)菌生長(zhǎng)、細(xì)菌陽(yáng)性孔有菌生長(zhǎng)為前提進(jìn)行結(jié)果判讀，以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為MIC。如果出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度，如果出現(xiàn)多處跳孔，則該次結(jié)果作廢。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 微量稀釋法檢測(cè)異烏藥內(nèi)酯對(duì)非H.pylori菌株MIC ①藥物制備：配置異烏藥內(nèi)酯濃度為4 mg/ml。②菌液準(zhǔn)備：將對(duì)數(shù)期菌液調(diào)整濃度細(xì)菌OD600為0.3(1×108CFU/ml)，稀釋至1×106CFU/ml，真菌調(diào)整濃度OD600為0.5(5×106CFU/ml)，稀釋至5×103CFU/ml，備用。③96孔板制備：以96孔板A1～A12孔作為藥物濃度最高孔，加入173.6 μl培養(yǎng)基及6.4 μl上述藥物，余下7孔均加入90 μl培養(yǎng)基，從上至下對(duì)倍稀釋至第8孔，使藥物濃度從1～8孔濃度分別為128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml。設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照孔、藥物陰性孔、細(xì)菌陽(yáng)性孔。④接種菌液：取上述備用菌液10 μl加至第1～8孔和陽(yáng)性孔中(細(xì)菌工作濃度為1×105CFU/ml，真菌工作濃度為5×102CFU/ml)，陰性孔不加菌對(duì)照。⑤結(jié)果判讀：以培養(yǎng)基空白對(duì)照孔、藥物陰性孔無(wú)菌生長(zhǎng)、細(xì)菌陽(yáng)性孔有菌生長(zhǎng)為前提進(jìn)行結(jié)果判讀，以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為MIC。如果出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度，如果出現(xiàn)多處跳孔，則該次結(jié)果作廢。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 異烏藥內(nèi)酯的分子結(jié)構(gòu)式及質(zhì)譜圖 異烏藥內(nèi)酯分子式為C15H16O3，分子結(jié)構(gòu)，如圖1A；異烏藥內(nèi)酯分子量為 244.29，質(zhì)譜為圖1B，鑒定圖譜由成都瑞芬思生物科技有限公司完成。

2.2 異烏藥內(nèi)酯對(duì)H.pylori菌株的抑制作用 對(duì)18種不同H.pylori菌株進(jìn)行MIC檢測(cè)，如表1所示，異烏藥內(nèi)酯對(duì)敏感、耐藥、甚至多重耐藥H.pylori菌株MIC均在8～16 μg/ml，表明異烏藥內(nèi)酯對(duì)H.pylori具有良好的抑制作用，且對(duì)不同H.pylori菌株間抑制作用強(qiáng)度相似，菌株耐藥性對(duì)其抑制作用無(wú)明顯影響。

A.異烏藥內(nèi)酯的分子結(jié)構(gòu)式；B.異烏藥內(nèi)酯的質(zhì)譜圖

表1 異烏藥內(nèi)酯對(duì)不同H.pylori菌株的抑制作用

2.3 異烏藥內(nèi)酯對(duì)非H.pylori菌株的抑制作用 為篩選異烏藥內(nèi)酯的抗菌譜，選擇金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、白色念珠菌、新生隱球菌、奇異變形桿菌、熱帶假絲酵母、空腸彎曲菌、枯草芽孢桿菌等20種細(xì)菌及真菌進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)表2。MIC均>128 μg/ml，表明異烏藥內(nèi)酯的對(duì)非H.pylori菌株抑制作用不明顯，對(duì)H.pylori菌株的抑制作用明顯優(yōu)于以上20種細(xì)菌及真菌，可專一作用于H.pylori菌株。

表2 烏藥成分異烏藥內(nèi)酯的對(duì)非H.pylori菌株的MIC檢測(cè)

3 討論

H.pylori在人類胃內(nèi)普遍定植，并成為威脅全人類健康的明確致癌物，抗生素耐藥性升高對(duì)根除造成嚴(yán)重影響，發(fā)現(xiàn)新藥物成為迫切需要[12]。中藥是我國(guó)傳統(tǒng)的藥材，目前已發(fā)現(xiàn)許多中藥在抗菌領(lǐng)域中起到一定作用，常見(jiàn)于具有清熱解毒功效的中藥，例如黃芩、金銀花、板藍(lán)根、連翹等[8]?；改鹊萚13]在針對(duì)烏藥的中藥學(xué)及其臨床應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)烏藥具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛及抗炎作用，同時(shí)對(duì)中樞神經(jīng)、消化系統(tǒng)和預(yù)防糖尿病腎病起到有益作用。早在20世紀(jì)70年代就發(fā)現(xiàn)烏藥具有抑制金黃色葡萄球菌、甲型溶血鏈球菌、傷寒沙門菌、變形桿菌、大腸埃希菌的作用[13]。后來(lái)張琳等[14]發(fā)現(xiàn)烏藥對(duì)空腸彎曲菌也起到抑菌作用，但烏藥成分異烏藥內(nèi)酯在抗菌中的研究鮮少見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，烏藥成分異烏藥內(nèi)酯具有較良好的抗H.pylori作用，其對(duì)敏感及耐藥菌株MIC均在8～16 μg/ml之間，但對(duì)除H.pylori以外的細(xì)菌及真菌抑制作用遠(yuǎn)不及對(duì)H.pylori的抑制作用，表明異烏藥內(nèi)酯對(duì)H.pylori作用具有專一性。除了穿心蓮內(nèi)酯、苦地膽內(nèi)酯、小白菊內(nèi)酯等外，中藥成分內(nèi)酯類抗菌作用的報(bào)道比較少[15-17]，而且其作用機(jī)制基本不清楚，對(duì)細(xì)胞膜或生物膜的作用可能性比較大。烏藥成分異烏藥內(nèi)酯特異性作用于H.pylori，這是非常值得探討的問(wèn)題，應(yīng)該不單是對(duì)細(xì)胞膜或生物膜作用，否則其抗菌特異性不會(huì)這么高。本文在烏藥中挖掘出異烏藥內(nèi)酯成分能專一抑制H.pylori，不僅對(duì)烏藥的抗菌成分添加新認(rèn)知，且為研發(fā)抗H.pylori的先導(dǎo)藥物提供非常有意義的候選化合物。

綜上所述，異烏藥內(nèi)酯對(duì)敏感和耐藥的H.pylori均具有良好的抑制效果，可專一作用于H.pylori，具有較好的研發(fā)前景。