賈悠然，張樹泉，秦 升

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250000； 2.泰安市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，山東 泰安 271000； 3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

腦梗死(cerebral infarction，CI)屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，指多種原因?qū)е碌哪X組織局部缺血性壞死，包括腦血管動(dòng)脈硬化、血栓等，在臨床中較為常見，占腦卒中的2/3以上[1]。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國致死率、致殘率均居首位的疾病為CI，且有1/4～3/4的CI患者在5年內(nèi)復(fù)發(fā)。此外，肢體功能障礙、神經(jīng)功能缺損、自理能力降低以及生活能力不足等為CI的常見癥狀，CI的發(fā)生嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，給患者家庭和社會(huì)帶來了極大的負(fù)擔(dān)[1]。研究結(jié)果證實(shí)，很多天然植物對(duì)治療腦缺血性疾病存在巨大的潛在價(jià)值。銀杏葉具有抗心腦血管疾病的作用。中醫(yī)以活血化瘀為原則治療中風(fēng)，加之銀杏葉具有活血化瘀之效，故用銀杏葉治療CI具有理論依據(jù)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏葉具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，減輕腦水腫，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善血漿同型半胱氨酸失衡，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低血小板聚集，抑制低密度脂蛋白氧化等藥理作用[2]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子角度，探討銀杏葉治療CI的潛在作用機(jī)制，為臨床中醫(yī)治療CI提供參考。

1 資料與方法

1.1 銀杏葉靶點(diǎn)收集

將藥物分布、吸收、代謝和排泄(ADME)模型與文獻(xiàn)相結(jié)合進(jìn)行篩選，確定研究需用的3個(gè)相關(guān)參數(shù)，即類藥性(DL)、口服生物利用度(OB)和血腦屏障(BBB)，根據(jù)已發(fā)表的研究結(jié)果進(jìn)行考量[3-4]，得出篩選標(biāo)準(zhǔn)為DL≥0.18、OB≥30%和BBB≥-0.3。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)，篩選出有高度活性的銀杏葉有效成分，同時(shí)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索高度活性有效成分的靶點(diǎn)，將收集到的靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt數(shù)據(jù)庫)，選擇已驗(yàn)證的信息，限定物種為人，得到相對(duì)應(yīng)的靶基因，并剔除重復(fù)和沒有靶點(diǎn)的有效成分，生成“有效成分-作用靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集。

1.2 CI靶點(diǎn)收集

利用GeneCards(https://www.genecards.org)、Drugbank(https://www.drugbank.com/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，http://www.omim.org/)和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)等數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“cerebral infarction”，收集CI相關(guān)靶點(diǎn)，整理后建立CI相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 銀杏葉-CI靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將銀杏葉有效成分作用靶點(diǎn)與CI相關(guān)靶點(diǎn)取交集，篩選出兩者的共同靶點(diǎn)，得到銀杏葉治療CI的相關(guān)靶點(diǎn)。用Venny圖(www.bioinformatics.com.cn/)繪制其結(jié)果。通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)將篩選得出的交集靶點(diǎn)構(gòu)建銀杏葉治療CI潛在靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，改置信度為0.4，刪掉游離節(jié)點(diǎn)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2(http://www.cytoscape.org/)，用插件cyto NCA獲取關(guān)鍵基因，其度值(Degree)序列均為靠前者。

1.4 對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析

通過Metascape(https://metascape.org/)對(duì)銀杏葉治療CI的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，其中GO包括生物過程、細(xì)胞組成及分子功能，并設(shè)置P<0.05，從而得到銀杏葉治療CI的主要功能富集信息及可能的信號(hào)通路。

1.5 構(gòu)建銀杏葉有效成分-CI靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

利用Cyto Scape 3.8.2內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，并根據(jù)通路富集結(jié)果判斷核心靶點(diǎn)、發(fā)揮藥效的主要活性成分以及主要通路關(guān)系，隨后運(yùn)用Cyto Scape 3.8.2構(gòu)建銀杏葉-CI靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

運(yùn)用Pub Chem下載有效成分的“SDF”格式文件，后通過Chem Bio3D Ultra軟件將其優(yōu)化，得到活性成分(小分子)的PDB格式文件；同時(shí)將交集靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)通過PDB數(shù)據(jù)庫下載，選擇格式為“PDB”，然后導(dǎo)入PyMol軟件中進(jìn)行去水、加氫、加減電荷等處理，得到蛋白晶體(大分子)的PDB格式文件。將2個(gè)文件運(yùn)用Auto Dock Tools軟件調(diào)整格式為PDBQT后為分子對(duì)接設(shè)置活性口袋，然后通過Autodock Vina軟件完成分子對(duì)接，后應(yīng)用pymol軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉有效成分和作用靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到銀杏葉有效成分10個(gè)，包括芝麻素、β-谷甾醇、豆甾醇和芫花素等，見表1。檢索到銀杏葉有效化學(xué)成分潛在作用靶點(diǎn)122個(gè)，見圖1。

圖1 有效成分的作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of action targets of the active components

表1 銀杏葉治療CI有效化學(xué)成分Tab 1 Active chemical components of Ginkgo biloba for the treatment of CI

2.2 CI靶點(diǎn)基因收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，選擇Score>中位數(shù)的靶點(diǎn)為CI的相關(guān)靶點(diǎn)，并與OMIM、DisGeNET、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫中獲得的相關(guān)靶點(diǎn)取并集，得到1 109個(gè)CI相關(guān)靶點(diǎn)，見圖2—3。

圖2 “有效成分-CI”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of “active components-CI” targets

2.3 銀杏葉-CI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將銀杏葉有效成分的作用靶點(diǎn)與CI相關(guān)靶點(diǎn)取交集，并通過ImageGP易漢博生物信息在線作圖網(wǎng)站(http://www.ehbio.com/)繪制韋恩圖，得到銀杏葉-CI共同靶點(diǎn)43個(gè)，見圖4。

圖4 “銀杏葉-CI”靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig 4 Venn diagram of target intersection of “Ginkgo biloba-CI”

通過STRING 11.0平臺(tái)(https://www.string-db.org/)將篩選所得共同靶點(diǎn)繪制銀杏葉-CI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖5。運(yùn)用Cytoscape 3.8.2對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，通過插件cytoNCA獲取度值排序靠前的基因(見圖6)，提示NOS3、JUN、CASP3、MAPK14、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、PPARG、ESR1和CCND1在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖5 “銀杏葉-CI”靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 5 PPI network of “Ginkgo biloba-CI” target

2.4 銀杏葉對(duì)CI相關(guān)靶點(diǎn)的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

銀杏葉對(duì)CI靶點(diǎn)的GO功能富集分析結(jié)果顯示，銀杏葉參與的生物學(xué)過程包括血液循環(huán)(blood circulation)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)(cellular response to organic cyclic compound)、膜筏(membrane raft)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)和氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)等，見圖7。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，涉及鈣信號(hào)、弓形體病、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路等，見圖8、表2。

圖7 銀杏葉治療CI靶點(diǎn)的GO功能富集分析Fig 7 GO functional enrichment analysis of Ginkgo biloba for the treatment of CI

圖8 銀杏葉治療CI靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis of Ginkgo biloba for the treatment of CI

2.5 “銀杏葉有效成分-CI靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cyto Scape 3.8.2構(gòu)建“銀杏葉有效成分-CI靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。利用Cyto Scape 3.8.2內(nèi)置工具分析各數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，可以得出在治療CI中的主要靶點(diǎn)有NOS3、JUN、CASP3、MAPK14和PTGS2，見表2。

圖9 “銀杏葉有效成分-CI靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 9 Network diagram of “active components of Ginkgo biloba-CI target-signaling pathway”

表2 銀杏葉治療CI的KEGG通路富集分析結(jié)果Tab 2 Results of KEGG pathway enrichment analysis of Ginkgo biloba for the treatment of CI

形狀越大，靶點(diǎn)越重要，度值越高the larger the shape, the more important the target and the higher the degree value圖6 PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)Fig 6 Core targets in PPI network

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

由“有效成分-作用靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)(圖1)可知，MOL000358、MOL000449、MOL001558、MOL011594和MOL005573等成分在藥物效用中起重要作用，且PTGS2、PTGS1、NCOA2、SCN5A和PGR等是銀杏葉發(fā)揮藥效的關(guān)鍵靶點(diǎn)。由“有效成分-CI靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)(圖3)可知，MOL000358、MOL011594、MOL001558、MOL00449和MOL001490等成分在銀杏葉治療CI中發(fā)揮重要作用。由PPI核心成分(圖5)可見，NOS3、JUN、CASP3、MAPK14和PTGS2等是銀杏葉治療CI的重要靶點(diǎn)。出于對(duì)藥物本身作用及藥物治療疾病作用2個(gè)方面的考量，將圖1與圖5分析得到的結(jié)果取交集，即PTGS2作為銀杏葉治療CI的核心成分及核心靶點(diǎn)；將圖1中排序居前5位的成分及圖3中排序居前5位的成分取并集，得到6個(gè)小分子，即MOL000358、MOL001558、MOL000449、MOL001490、MOL011594和MOL005573。將6個(gè)小分子與大分子蛋白(PTGS2)分別進(jìn)行模擬對(duì)接，通過結(jié)合能(affinity)評(píng)估并分析對(duì)接結(jié)果。

圖3 CI靶點(diǎn)基因并集韋恩圖Fig 3 Venn diagram of CI target gene concatenation

有研究結(jié)果表明，結(jié)合能越小表示分子對(duì)接結(jié)合效果越好，一般而言，結(jié)合能<-25 115.11 J/mol表示結(jié)合活性較好，結(jié)合能<-37 672.67 J/mol則表示結(jié)合活性非常強(qiáng)。MOL000358、MOL001558、MOL000449、MOL001490、MOL011594和MOL005 573分別對(duì)應(yīng)的活性成分為β-谷甾醇、芝麻素、豆甾醇、雙[(2S)-2-乙基己基]苯-1,2-二羧酸酯、異戊環(huán)素和芫花素，故將其與PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接，見圖10。對(duì)接結(jié)果顯示，芝麻素-PTGS2結(jié)合能為-48 555.88 J/mol，異戊環(huán)素-PTGS2結(jié)合能為-42 277.10 J/mol，芫花素-PTGS2結(jié)合能為-38 509.84 J/mol，豆甾醇-PTGS2結(jié)合能為-32 649.64 J/mol，雙[(2S)-2-乙基己基]苯-1,2-二羧酸酯-PTGS2結(jié)合能為-27 626.62 J/mol，β-谷甾醇-PTGS2結(jié)合能為-29 719.55 J/mol。配體和受體結(jié)合能越低，二者結(jié)合越穩(wěn)定。故認(rèn)為芝麻素、異戊環(huán)素、芫花素與PTGS2均有較強(qiáng)的結(jié)合活性，且各活性成分與目標(biāo)受體蛋白對(duì)接的結(jié)果均<-25 115.11 J/mol，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果。

3 討論

CI指因腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致局限性腦組織的缺血性壞死或軟化，而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損[5]。常表現(xiàn)為偏身麻木、半身不遂、口舌歪斜和吞咽困難等，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[6]。腦血管的阻塞有一個(gè)發(fā)生、發(fā)展的過程，要針對(duì)不同的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行不同的治療，如抗栓治療(抗血小板、抗凝治療)、應(yīng)用他汀類藥物、改善腦側(cè)支循環(huán)、腦保護(hù)以及影響腦部供血的全身基礎(chǔ)治療(如調(diào)整血壓、穩(wěn)定血糖和營養(yǎng)支持)等[5]。另外，可根據(jù)不同的病情應(yīng)用丹參類、紅花類、銀杏葉類、三七類和水蛭類等活血化瘀類中藥注射劑靜脈滴注，有利于阻止病情發(fā)展[5]。臨床對(duì)CI的處理應(yīng)強(qiáng)調(diào)早期診斷、早期治療、早期康復(fù)和早期預(yù)防再發(fā)[5]。鐘靜梅[7]對(duì)47項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)銀杏葉具有提高急性CI治療有效率的作用，從而改善神經(jīng)功能缺損程度。汪素娟等[8]對(duì)大量研究進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，黃酮苷類、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯等銀杏葉的有效成分具有改善微循環(huán)、溶解纖維蛋白原、下調(diào)血漿黏稠度、抑制血小板聚集和增加紅細(xì)胞變形及攜氧能力的作用。潘洪平[9]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏葉可優(yōu)化腦循環(huán)系統(tǒng)，改善學(xué)習(xí)能力，減少發(fā)生衰老、癡呆和腦功能障礙的概率。朱旦華等[10]的研究結(jié)果表明，銀杏葉可以改善高脂血癥，且對(duì)全血高切黏度、全血低切黏度、血小板黏附率和血球積壓有降低作用，從而對(duì)CI的發(fā)生有預(yù)防作用。

中醫(yī)學(xué)對(duì)中風(fēng)的認(rèn)識(shí)最早源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如“陽氣者，大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”，又如“血之與氣并走于上，則為大厥”。而后，歷代醫(yī)家對(duì)于中風(fēng)的認(rèn)識(shí)逐漸寬泛，目前主流思想認(rèn)為其主要由虛、火、風(fēng)、痰、氣等5種病理因素使氣機(jī)無力、逆亂，精血停滯、瘀阻，進(jìn)一步生成瘀血，痰濕阻滯腦絡(luò)、腦脈，從而導(dǎo)致清陽不升，元神失司，腦髓肢體缺于濡養(yǎng)，出現(xiàn)突然昏仆、半身不遂、肢體麻木、舌蹇不語、口舌歪斜和偏身麻木等癥狀。其中又以陰虛、氣虛最為根本，陰虛則化血無源、血液黏滯，氣虛則血行無力、氣血失和。故認(rèn)為中風(fēng)發(fā)病的主要因素為瘀血、痰濕。CI的臨床治療多以中西醫(yī)結(jié)合治療為主，兩者相互補(bǔ)充，如西醫(yī)采用改善腦循環(huán)作用的藥物，大部分活血化瘀類中藥均具有改善腦循環(huán)的作用，兩者合用效佳[5]。藍(lán)桂彬等[11]的研究結(jié)果顯示，銀杏具有較強(qiáng)的活血化瘀作用，因其含有黃酮類、內(nèi)酯類和聚戊烯醇等化合物。

A.芝麻素-PTGS2；B.芫花素-PTGS2；C.異戊環(huán)素-PTGS2；D.雙[(2S)-2-乙基己基]苯-1,2-二羧酸酯-PTGS2；E. 豆甾醇-PTGS2；F.β-谷甾醇-PTGS2A.sesamin-PTGS2；B.genkwanin-PTGS2；C.isogoycyrol-PTGS2；D.bis[(2S)-2-ethylhexyl] benzene-1,2-dicarboxylate；E.stigmasterol-PTGS2；F.beta-sitosterol-PTGS2圖10 分子對(duì)接模式圖Fig 10 Diagram of molecular docking model

本研究篩選出銀杏葉活性成分共10個(gè)，β-谷甾醇、芝麻素及豆甾醇等是與CI相關(guān)靶點(diǎn)作用最多的化學(xué)成分，提示其可能與銀杏葉治療CI密切相關(guān)。(1)β-谷甾醇。劉威良等[12]的研究結(jié)果顯示，β-谷甾醇有較強(qiáng)的抗氧化活性，主要表現(xiàn)為能增加谷胱甘肽過氧化物酶及超氧化物歧化酶活性，同時(shí)降低過氧化氫酶的活性。Choi等[13]和Valerio等[14]的研究結(jié)果均顯示，β-谷甾醇具有較強(qiáng)抗炎作用，可提高抗炎因子白細(xì)胞介素(IL)10的活性，減少腫瘤壞死因子α及IL-1等炎癥因子的分泌。Feng等[15]的研究結(jié)果指出，β-谷甾醇具有較好的降脂作用，可降低機(jī)體對(duì)膽固醇、膽汁酸和膳食脂質(zhì)的吸收與再吸收。此外，因膳食中的β-谷甾醇可順利通過BBB，攝入β-谷甾醇可有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[16]。頸動(dòng)脈粥樣硬化是CI的病因之一，有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化可減少CI的發(fā)生[17]。(2)芝麻素。芝麻素能降低神經(jīng)元損傷，保護(hù)神經(jīng)元[18]。(3)豆甾醇。有研究結(jié)果顯示，豆甾醇具有抗炎、抗氧化等作用[19]。除上述成分外，KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)的潛在通路也在CI發(fā)病中起重要作用。如鈣信號(hào)通路，根據(jù)“鈣穩(wěn)態(tài)假說”[20-21]，因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平升高，繼發(fā)神經(jīng)元內(nèi)鈣水平失衡，加劇神經(jīng)毒性，影響突觸的可塑性及神經(jīng)元的興奮性[22-23]。PI3K-Akt通路不僅為細(xì)胞存活提供保障，還能在神經(jīng)營養(yǎng)因子激活下，抑制細(xì)胞凋亡。推測上述化學(xué)成分可能是銀杏葉治療CI的潛在藥效靶點(diǎn)，并通過抗炎、抗氧化及抗凋亡等通路發(fā)揮抗CI作用。結(jié)合CI的病理生理機(jī)制，得出銀杏葉的有效成分通過調(diào)控參與CI炎癥、氧化及凋亡等過程，對(duì)CI的發(fā)生與變化有一定影響。

銀杏葉有效成分靶點(diǎn)122個(gè)，CI相關(guān)靶點(diǎn)1 109個(gè)，通過PPI 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)43個(gè)共同靶標(biāo)，為銀杏葉治療CI的潛在作用靶標(biāo)；根據(jù)度值，對(duì)銀杏葉發(fā)揮藥物效用靶點(diǎn)的前5位(PTGS2、PTGS1、NCOA2、SCN5A和PGR)與銀杏葉治療CI靶點(diǎn)的前5位(NOS3、JUN、CASP3、MAPK14和PTGS2)取交集，得到PTGS2為銀杏葉治療CI的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。PTGS2為炎癥過程中花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，已被證實(shí)在CI的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[24]。

綜上所述，銀杏葉可能通過β-谷甾醇、豆甾醇和芝麻素等活性成分，作用于PTGS2等相關(guān)靶點(diǎn)，經(jīng)鈣信號(hào)、PI3K-Akt信號(hào)等通路，參與炎癥、氧化及凋亡等活動(dòng)，從而發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療CI的藥理作用，為闡明中醫(yī)藥治療疾病的機(jī)制提供了新方法、新依據(jù)。