李 健 楊樂天,2 綜述 趙宇亮,2 審校

急性腎損傷(AKI)表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)腎功能快速下降,發(fā)病率和重癥患者死亡率均較高,部分AKI患者腎功能無法恢復(fù),可進(jìn)展至慢性腎臟病甚至終末期腎病[1]。AKI常見病因包括缺血/再灌注損傷(IRI)、膿毒癥及腎毒性藥物(如順鉑)等,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,氧化應(yīng)激、炎癥、免疫損傷等因素均可能參與其中。目前AKI患者的管理以對(duì)癥為主,臨床上尚缺乏針對(duì)性的治療藥物。既往研究表明活性氧(ROS)與AKI密切相關(guān),ROS含量失調(diào)可引起氧化應(yīng)激,觸發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死,最終引起AKI[2]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4(NOX4)是體內(nèi)ROS重要來源之一,在各型AKI中出現(xiàn)異常表達(dá),可能在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用,而以NOX4為治療靶點(diǎn)的干預(yù)策略也逐漸受到學(xué)界的重視。本文總結(jié)NOX4在AKI中的作用機(jī)制及其應(yīng)用前景,為探究AKI新型治療靶點(diǎn)提供思路。

NOX家族

NOX家族是通過生物膜向氧傳遞電子生成超氧化物的一種蛋白質(zhì)類的酶[3],由NOX1、 NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2七種亞型組成[4]。其中NOX4在腎臟中高表達(dá),通過催化亞基促使電子從NADPH轉(zhuǎn)移到氧分子上形成過氧化氫(H2O2),是組織細(xì)胞 ROS的主要來源之一,在糖尿病腎病、腎癌、AKI等多種腎臟疾病發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,因此我們重點(diǎn)關(guān)注NOX4,并對(duì)其定位、性質(zhì)和作用進(jìn)行總結(jié)。Geiszt等[5]通過原位雜交實(shí)驗(yàn)確定了在小鼠腎臟中NOX4 mRNA定位于腎皮質(zhì),且主要位于近端小管的上皮細(xì)胞;而在人類腎臟中發(fā)現(xiàn)NOX4 mRNA主要位于髓質(zhì)集合管和腎乳頭上皮中。Gorin等[6]發(fā)現(xiàn)腎小管系膜細(xì)胞中也較低水平表達(dá)NOX4。ROS的主要作用包括細(xì)胞防御、激素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白耦聯(lián)受體活化、調(diào)節(jié)離子通道的活性等,同時(shí)也參與轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。當(dāng)組織中ROS過量時(shí),又會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,造成嚴(yán)重的病理損傷[4],是導(dǎo)致AKI發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

NOX4與AKI

NOX4與許多腎臟疾病有密切的關(guān)系。糖尿病腎病中系膜細(xì)胞和足細(xì)胞中NOX4表達(dá)增加,使得ROS生成增多,進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷,是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一[7]。在梗阻性腎病中,如小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型中,NOX4誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,引起線粒體損傷和腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡,也有研究顯示在UUO模型中NOX4在損傷的腎小管中表達(dá)減少[8]。NOX4還通過激活下游信號(hào)通路介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ從而誘導(dǎo)的腎臟損傷[9],在高血壓腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。同時(shí)NOX4也是腎癌細(xì)胞ROS的主要來源,通過促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子2(HIF-2)的表達(dá)在腎腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。以下針對(duì)NOX4在各型AKI中的作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

膿毒癥AKI(SAKI)膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。腎臟是其中最容易累及的器官之一,易導(dǎo)致SAKI[11]。SAKI的病理生理機(jī)制很復(fù)雜,目前尚未完全明確,主要包括凝血功能紊亂,炎癥因子風(fēng)暴,小管上皮細(xì)胞能量代謝障礙等。

研究認(rèn)為SAKI時(shí)NOX4過度激活產(chǎn)生大量ROS,引起腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡壞死和SAKI[3]。Sureshbabu等[12]的研究中利用脂多糖(LPS)刺激人腎近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)建立SAKI腎小管損傷的體外模型,以盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)建立體內(nèi)模型。實(shí)驗(yàn)顯示,模型組HK-2細(xì)胞和小鼠腎臟組織磷酸化受體相互作用蛋白激酶3(p-RIPK3)和磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(p-MLKL)的表達(dá)水平較對(duì)照組均增加,繼而通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制上調(diào)NOX4表達(dá)和線粒體易位,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙,誘發(fā)SAKI。

Yoo等[13]發(fā)現(xiàn)含 Ysc84 樣1的Src 同源 3 域(SH3YL1)中的SYLF結(jié)構(gòu)域可與NOX4的NADPH結(jié)合位點(diǎn)相互作用。LPS可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中的內(nèi)源性NOX4高表達(dá),與SH3YL1和p22phox結(jié)合成為三元復(fù)合物,其中SH3YL1充當(dāng)銜接蛋白。當(dāng)在小鼠腹腔注射LPS后,首先作用于Toll樣受體(TLR),激活下游級(jí)聯(lián)激酶,如脾酪氨酸激酶(Syk)等。Bae等[14]也指出Syk在TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用,使得SH3YL1的酪氨酸位點(diǎn)磷酸化,進(jìn)一步形成三元復(fù)合物,激活后續(xù)通路。TLR4-SH3YL1-NOX4級(jí)聯(lián)在LPS誘導(dǎo)的腎損傷中起重要作用。Park等[15]的研究指出了NOX4末端的COOH末端區(qū)域參與了LPS介導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)的活化。該通路活化可生成H2O2,活化NF-κB,生成促炎因子[白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)]等,也有研究表明[16],巨噬細(xì)胞中的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)也通過此通路活化,NLRP3激活的第一階段由TLR4受體誘導(dǎo),使得NF-κB通路活化,啟動(dòng)IL-1β,IL-18和NLRP3的轉(zhuǎn)錄和翻譯,第二階段ROS等刺激信號(hào)與NLRP3受體結(jié)合,自我激活水解產(chǎn)生含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1),這是引起炎癥的主要原因[16],從而使得腎臟中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多,并介導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡等,最終引起SAKI(圖1)。

圖1 膿毒癥AKI的NOX4相關(guān)通路示意圖NOX4:NADPH氧化酶4;AKI:急性腎損傷;RIPK3:受體相互作用蛋白激酶3;MLKL:混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域;SH3YL1:含 Ysc84 樣1的Src 同源 3 域;TLR: Toll樣受體;Syk:脾酪氨酸激酶;NLRP3:核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3;NF-κB:核因子κB;IL-1β:白細(xì)胞介素1β;caspase-1:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1

順鉑相關(guān)AKI順鉑是一種經(jīng)典的化療劑,可用于多種腫瘤的治療,但由于存在骨髓抑制、腎毒性和耳毒性等副作用,其使用常受限[17]。ROS導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞(RTECs)損傷是順鉑誘導(dǎo)AKI的主要原因[18]。Dutta等[19]研究發(fā)現(xiàn)在順鉑誘導(dǎo)的AKI中,順鉑會(huì)激活肌醇加氧酶(MIOX),從而激活NOX4并引起后續(xù)的反應(yīng)。而在另一個(gè)研究中提出[20],當(dāng)順鉑誘導(dǎo)時(shí),原本在腎小管內(nèi)高表達(dá)的硒蛋白T(SelT)表達(dá)減少,促使NOX4的活化,促進(jìn)了ROS的積累。 Meng等[21]的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NOX4后順鉑誘導(dǎo)的腎損傷分子1(KIM-1)上調(diào),炎癥細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的表達(dá)水平均增加,從而加速了順鉑誘導(dǎo)的AKI;在體外實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)NOX4的HK-2細(xì)胞中,RIP1/RIP3/MLKL軸被激活,并促進(jìn)了Caspase-3的裂解,導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生,最終誘發(fā)AKI(圖2)。

圖2 順鉑相關(guān)AKI的NOX4相關(guān)通路示意圖NOX4:NADPH氧化酶4;AKI:急性腎損傷;PA:原兒茶醛;DEX:右美托咪啶;DIM：二吲哚基甲烷；MIOX:肌醇加氧酶;SelT:硒蛋白T;ROS:活性氧簇;KIM-1:腎損傷分子1;IL-1β:白細(xì)胞介素1β;TNF-α:腫瘤壞死因子α;caspase-3:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3

IRI相關(guān)AKIIRI是AKI常見的原因之一,在腎移植過程中不可避免,可能激活固有免疫而引起炎癥和細(xì)胞損傷。目前已經(jīng)有研究表明低氧會(huì)造成轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)的上調(diào),Cho等[22]進(jìn)一步研究證明了TGF-β1/Smad/NOX4途徑激活細(xì)胞凋亡。除Smad通路外,TGF-β1還通過PI3K通路、 MAPK通路和RhoA/ROCK通路上調(diào)NOX4的表達(dá)[23]。Li等[24]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A(MRTF-A)通過與乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST1相互作用促進(jìn)H4K16乙酰化,并激活NOX4的轉(zhuǎn)錄,表達(dá)NOX4。Ben Mkaddem等[25]通過夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂模擬IRI,發(fā)現(xiàn)低氧條件會(huì)刺激NOX4和TLR4相互作用,在低氧誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/c-Jun氨基末端激酶(ASK1/JNK)通路,即Cho等[22]提出的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs) 途徑中發(fā)揮重要作用,從而增加p-JNK和p-p38的含量,產(chǎn)生ROS,導(dǎo)致AKI。2018年Jeong等[26]的研究也證明了MAPKs通路激活后產(chǎn)生的ROS在IRI-AKI細(xì)胞凋亡中扮演了重要作用。

2016年的一項(xiàng)研究則認(rèn)為NOX4在IRI中發(fā)揮保護(hù)作用[27]。在該研究中NOX4敲除小鼠較野生型小鼠腎功能下降,腎小管凋亡加重,Bcl-2表達(dá)降低,核因子2(NRF2)活性降低。體外試驗(yàn)中沉默NOX4細(xì)胞具有明顯的凋亡傾向,NRF2、谷胱甘肽含量和Bcl-2表達(dá)降低。NRF2是一種轉(zhuǎn)錄因子,在防止過度氧化中發(fā)揮重要作用,Bcl2是一種抗凋亡蛋白,NRF2是一種轉(zhuǎn)錄因子,NOX4可能通過改變Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)的氧化狀態(tài)來調(diào)節(jié)NRF2的活性,繼而影響谷胱甘肽的合成和氧化應(yīng)激水平[28]。同時(shí)也有研究表明NOX4通過調(diào)節(jié)真核起始因子2(eIF2)的亞基eIF2α介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)應(yīng)激條件下的細(xì)胞,從而保護(hù)腎小管細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡[29]。這些研究提示的NOX4保護(hù)性作用與其他研究所認(rèn)為的NOX4在AKI扮演的致病作用有很大的不同。NOX4對(duì)AKI的保護(hù)或損傷作用有可能取決于不同細(xì)胞和不同情況下需要ROS量的差異(圖3)。

圖3 IRI相關(guān)AKI的NOX4相關(guān)通路示意圖IRI：缺血/再灌注損傷；NOX4:NADPH氧化酶4;AKI:急性腎損傷;MRTF-A:肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A;MAPKs:絲裂原活化蛋白激酶;MYST1:乙酰轉(zhuǎn)移酶;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子;ROS:活性氧簇;TLR4:Toll樣受體4;MG149:2-[2-(4-庚基苯基)乙基]-6-羥基苯甲酸;MRTD-A與MYST1相互作用促進(jìn)H4K16乙?；?并促進(jìn)NOX4的表達(dá)

潛在干預(yù)靶點(diǎn)

直接干預(yù)NOX4體外試驗(yàn)中原兒茶醛(PA)可靶向作用于NOX4,抑制RIP1/RIP3/MLKL軸,顯著降低了順鉑誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生,從而減少炎癥和細(xì)胞凋亡,對(duì)AKI有一定的緩解作用[30](圖1、2)。

右美托咪啶(dexmedetomidine,DEX)在用LPS構(gòu)建的大鼠體內(nèi)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)可抑制TLR4、NOX4、NF-κB和NLRP3等的表達(dá),即通過抑制TLR4/NOX4/NF-κB途徑,減輕炎癥和氧化應(yīng)激,從而緩解膿毒性AKI[31]。迄今共有10項(xiàng)使用DEX治療AKI臨床試驗(yàn)注冊(cè),尚未見相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果的文獻(xiàn)報(bào)道。

硒蛋白T(SelT)可能作為新的靶點(diǎn),降低NOX4和ROS的含量,抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,在順鉑誘導(dǎo)的AKI中發(fā)揮重要作用,但具體機(jī)制尚未明確[20]。

膽鈣化醇是維生素D3的一種非活性形式,在缺血/再灌注誘導(dǎo)的小鼠AKI體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏媚戔}化醇預(yù)處理可抑制NOX的亞基p47phox和gp91phox,從而減輕腎臟病理損傷和AKI[32]。體內(nèi)、外試驗(yàn)中杜鵑素均可抑制MAPK途徑,并下調(diào)p-NF-κB和NLRP3蛋白質(zhì)表達(dá)以抑制炎癥,抑制NOX4的產(chǎn)生,同時(shí)杜鵑素還可通過激活NRF2抑制炎癥和氧化應(yīng)激從而對(duì)AKI 有一定的治療效果[33]。在AKI小鼠模型中3,3‘-二吲哚基甲烷可有效地阻斷LPS誘導(dǎo)的NOX4和NOX2的表達(dá),從而減少ROS的產(chǎn)生,抑制腎小管的氧化應(yīng)激,但本實(shí)驗(yàn)中并未描述DIM如何調(diào)節(jié)NOX4的表達(dá)[34]。

干預(yù)NOX4上游信號(hào)有研究發(fā)現(xiàn)[24],MG149可有效抑制MYST1,而MYST1是組蛋白H4K16乙酰轉(zhuǎn)移酶,與MRTF-A構(gòu)成復(fù)合體,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞基因的表達(dá)。使用MG149抑制MYST1,可通過MRTF-A-Myst1-NOX通路發(fā)揮對(duì)AKI的保護(hù)作用。

恩格列凈通過作用于β羥基丁酸鹽而抑制NOX的表達(dá),但是由于相關(guān)的炎癥因子并未減少,因此并不能減輕炎癥[35],提示恩格列凈對(duì)AKI的保護(hù)作用可能并不依賴炎癥通路。

小結(jié):NOX4是AKI的發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié),了解NOX4在AKI中的作用對(duì)于開發(fā)AKI的新型治療藥物有重要的意義,以NOX4為靶點(diǎn)的治療策略也引起了越來越多的關(guān)注。目前研究提示NOX4通過不同信號(hào)通路在SAKI、順鉑相關(guān)AKI、IRI相關(guān)AKI等疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,但也有研究認(rèn)為NOX4是AKI的保護(hù)性因素。今后有賴于更多研究對(duì)不同AKI類型、不同病程階段下NOX4和ROS表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化加以觀察,以尋找恰當(dāng)?shù)闹委煏r(shí)機(jī)和干預(yù)強(qiáng)度,并在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證,為潛在的臨床轉(zhuǎn)化過程奠定基礎(chǔ)。