林素英， 謝麗燕， 陳 宇， 林 旺， 王振輝

( 1.莆田學院 環(huán)境與生物工程學院， 福建 莆田 351100；2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室， 福建 莆田 351100 )

0 引言

日落黃(SY)是一種人工合成的水溶性偶氮類色素， 具有穩(wěn)定性高、 著色力強、 價格相對低廉的優(yōu)點， 被廣泛應(yīng)用于食品、 藥物及化妝品的著色。 研究表明， 過量攝入日落黃可能引發(fā)過敏反應(yīng)、 腎臟和肝臟損害等問題[1]； 《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》 (GB 2760—2014)規(guī)定， 日落黃在不同種類食品中的最大允許使用量為0.025～0.500g/kg[2]。 可見， 探索一種快速、 靈敏的檢測方法來對食品中日落黃含量進行監(jiān)測， 具有重要意義。 目前國內(nèi)外的檢測方法主要有色譜法、 光譜法、 化學發(fā)光法及電化學法等[3]， 其中電化學法是通過物質(zhì)在溶液中的電化學行為進行分析的。 相較于傳統(tǒng)的檢測手段， 電化學法具有靈敏度高、 儀器設(shè)備簡單、 操作便捷的優(yōu)點， 可用于快速檢測以及大批量樣品的檢測， 在食品分析等領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用[4]。

要使電化學法發(fā)揮其特別優(yōu)勢， 需對工作電極進行修飾與設(shè)計。 石墨烯材料具有力學強度高、 導(dǎo)電性好、 催化活性大等特點[5]， 在開發(fā)具有優(yōu)異電分析性能的電化學傳感器方面得到廣泛的研究。 采用不同石墨烯基材料修飾電極進行日落黃測定已有報道， 如胡晴晴等制備了聚L-精氨酸/石墨烯修飾電極[6]， 張金磊等制備了石墨烯量子點修飾電極[7]， 付菊等制備了聚嘧啶/石墨烯復(fù)合膜修飾電極[8]。 不過， 石墨烯存在生物相容性不好、 難分離等問題， 可構(gòu)建復(fù)合物提高電化學活性并減少團聚[9]。 殼聚糖表面含有氨基、 羥基、 乙酰氨基、 螯合基等活性官能團[10]， 成膜性好。 基于石墨烯-殼聚糖構(gòu)建的電化學傳感器具優(yōu)良的生物相容性、 電子傳輸性及催化性[11]。 Feng 等制備了殼聚糖/氧化石墨烯復(fù)合材料用于檢測三聚氰胺[12]， 樊雪梅等用氧化石墨烯-殼聚糖(GO-CS)復(fù)合膜修飾電極測定尿酸[13]。 Magerusan 等通過電化學剝離石墨棒獲得殼聚糖/石墨烯納米材料用于修飾電極， 測定日落黃檢測檢出限為0.066 6 μmol/L[14]。 但這些方法存在修飾電極制備步驟繁瑣、 操作不易等缺點。 本研究通過溶液共混法， 制備了GO-CS 復(fù)合溶液， 用滴涂法修飾玻碳電極(GCE)， 研究日落黃在該修飾電極上的電化學行為， 通過差分脈沖伏安法(DPV)來確定測定日落黃含量的最優(yōu)條件。 提出了一種檢測日落黃的新方法， 為快速、 靈敏測定食品中日落黃含量提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與主要試劑

電化學分析儀(MEC-12B，江蘇江分電分析儀器有限公司)； 超純水凈水器(AXLC1820，上海富詩特儀器設(shè)備有限公司)； 分析天平(BSA224S，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)； 移液槍(1～10 μL，德國艾本德公司)； 超聲波清洗器(KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司)； 酸度計(PBS-25，深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備公司)。

石墨烯(GO，北京瑩宇電子科技有限公司，厚度0.34～3.40 nm，片徑30 ～50 nm)； 日落黃、 乙酸、 磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司，AR)； 亞鐵氰化鉀、 鐵氰化鉀、 氯化鉀、 殼聚糖(CS)、 無水乙醇、 氫氧化鉀、 鹽酸(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠，AR)； 實驗用水為超純水。

磷酸鹽緩沖液(PBS): 采用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制成0.1mol/L 溶液， 用KOH 溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值。 日落黃用超純水配制成1×10-3mol/L 儲備液， 低溫避光保存， 使用時用PBS 稀釋至所需濃度。 鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液濃度為1.0×10-3mol/L， 含0.1 mol/L 電解質(zhì)氯化鉀。

1.2 修飾電極的制備

將GCE 在麂皮上依次用0.1、 0.3、 0.05 μm的Al2O3粉拋光成鏡面， 再分別用超純水、 1 ∶1 HNO3溶液、 無水乙醇將殘留在電極表面的拋光材料沖洗干凈， 晾干。 清洗完的電極采用循環(huán)伏安法(CV)在0.5 mol/L H2SO4溶液中活化， 在鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀中檢驗至氧化還原峰電位差在90 mV 以下， 即GCE 預(yù)處理完畢， 將電極取出， 洗凈備用[15]。

將適量CS 溶解于5%(體積比)的乙酸水溶液中， 制成1 g/L 的CS 溶液。 在攪拌下將5.0 mg GO 超聲分散于10 mL CS 溶液中， 制成0.5 g/L 的GO-CS 復(fù)合溶液。

用移液槍移取5.0 μL GO-CS 復(fù)合溶液， 滴涂在預(yù)處理好的GCE 表面， 再置于35℃烘箱中干燥30 min， 制得GO-CS/GCE(即修飾電極)。

1.3 實驗方法

以GO-CS/GCE 為工作電極、 鉑絲電極為輔助電極、 Ag/AgCl 電極為參比電極， 構(gòu)建三電極體系， 采用CV 對GO-CS/GCE 進行表征， 利用DPV 對日落黃進行檢測， 考察電位范圍、 溶液pH 值、 富集電位、 富集時間及干擾物質(zhì)對日落黃測定的影響。 為使GO-CS/GCE 恢復(fù)活性， 單次掃描后需將電極置于空白的PBS 中掃描曲線穩(wěn)定， 才能進行下次測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO-CS/GCE 的表征

2.1.1 掃描電子顯微鏡(SEM)圖

圖1a 為GO/GCE 的SEM 圖， 可以看到電極表面具有層狀褶皺， 顯著增大了電極的比表面積。 圖1b ～d 為不同倍數(shù)的GO-CS/GCE 的SEM圖， 可見CS 分布于GO 表面， 增加電極的活性位點[10]， 進而增強對日落黃的響應(yīng)能力。

圖1 修飾電極的SEM 圖

2.1.2 CV 表征

分別以GCE、 GO-CS/GCE 為工作電極， 置于1×10-4mol/L 的日落黃(pH ＝2.5)溶液中進行CV 掃描， 于富集電位0.1 V 時富集1 min， 電位范圍0.4 ～0.8 V， 掃描速度100 mV/s， 結(jié)果如圖2 所示。 可見日落黃在GCE 上的響應(yīng)弱，而在GO-CS/GCE 上有明確的氧化還原峰， 且峰電流明顯增大， 這可能是因為GO-CS 修飾增大了比表面積， 且CS 的活性官能團有利于日落黃在電極表面的吸附， 有效地加快了電子轉(zhuǎn)移速率。

圖2 日落黃在不同電極上的CV 圖

2.2 測定條件優(yōu)化

采用DPV 優(yōu)化測試條件， 日落黃濃度為2.5×10-5mol/L。

2.2.1 測定電位范圍

測定電位范圍為-0.2 ～1.4 V， pH ＝2.5，富集電位為0.1 V， 富集時間為1 min。 在DPV掃描中發(fā)現(xiàn)峰電位隨高電位增大而右移， 在0.4 ～0.8 V 的區(qū)間峰形最銳利， 峰電流最大。 因此選擇0.4 ～0.8 V 為后續(xù)測試的電位范圍。

2.2.2 pH 值的影響

參照2.2.1 方法， 改變測試溶液pH 值(分別為2.5、5.0、6.5、7.0、8.0)， 測定日落黃溶液在不同pH 值下的DPV 曲線， 見圖3。 由圖3 可見， 隨著pH 值增大， 日落黃溶液的氧化峰電位出現(xiàn)負移， 峰電流整體減小趨勢明顯， 為提高測試靈敏度， 溶液pH 值應(yīng)選擇2.5。

圖3 日落黃在不同pH 值下的DPV 曲線

2.2.3 富集電位的影響

富集電位和富集時間是影響修飾電極性能的主要因素[14]。 為提高電極的靈敏度， 研究了不同富集電位時日落黃溶液(pH ＝5.0，富集時間2 min)的DPV 曲線， 富集電位-0.2 ～0.4 V， 每次增大0.1 V， 結(jié)果見圖4。 可見日落黃溶液峰電流與富集電位的關(guān)系曲線呈先增大后減小的趨勢， 富集電位為0.1 V 時峰電流達到最大， 超過0.3V 后峰電流顯著下降(可能是因為隨著富集電位的增大色素會分解[15])， 故確定富集電位為0.1V。

圖4 日落黃溶液中峰電流與富集電位關(guān)系圖

2.2.4 富集時間的影響

設(shè)定pH＝5.0， 富集電位為0.1 V， 富集時間為1 ～3 min， 圖5 記錄了日落黃溶液峰電流與富集時間的關(guān)系。 由圖5 可見， 峰電流隨著富集時間的增加先增后降， 在1 min 時達到最大，隨后緩慢降低， 說明1 min 時富集量已經(jīng)達到最大， 后續(xù)測試設(shè)定富集時間為1 min。

圖5 日落黃溶液中峰電流與富集時間關(guān)系圖

2.3 線性范圍與檢出限

采用DPV 研究了不同濃度的日落黃溶液在最佳條件下的電化學行為。 測試參數(shù)設(shè)置如下:測試電位范圍0.4 ～0.8 V， 溶液pH ＝2.5， 富集電位0.1 V， 富集時間1 min。 圖6 是不同濃度日落黃溶液在GO-CS/GCE 上的DPV 曲線。 由圖6 可見， 峰電流隨濃度增大而增大， 峰電位會向右微移， 由于濃度為4×10-5和5×10-5mol/L 的DPV 曲線變形明顯， 故僅討論1×10-7～3×10-5mol/L 范圍內(nèi)峰電流與濃度的關(guān)系。 結(jié)果如圖7所示， 峰電流與日落黃濃度呈線性關(guān)系， 線性方程為I(μA)＝0.7967c(μmol/L)＋9.5644，相關(guān)系數(shù)R2＝0.997 6，檢出限為8.4×10-8mol/L(信噪比S/N＝3)。

圖6 不同濃度日落黃溶液的DPV 曲線

圖7 峰電流與日落黃濃度的線性關(guān)系圖

2.4 GO-CS/GCE 的重現(xiàn)性、 穩(wěn)定性和抗干擾性

制作4 支GO-CS/GCE 用于3×10-6mol/L 日落黃溶液的檢測， 相對偏差為4.08%， 用同一根電極對日落黃溶液平行測定5 次， 電流響應(yīng)值相對標準偏差(RSD)為3.78%， 說明GO-CS/GCE 重現(xiàn)性良好。 測試后的GO-CS/GCE 置于PBS(pH＝7.0)溶液中連續(xù)掃描至曲線穩(wěn)定， 在4℃下保存一周， 對日落黃溶液進行測定， 發(fā)現(xiàn)峰電流降至原來的91.7%， 表明電極具有不錯的穩(wěn)定性。 按相同的實驗方法， 考察了常見食品中所包含的干擾物的影響， 結(jié)果表明100 倍濃度的葡萄糖、 尿酸、 草酸、 檸檬酸、 檸檬酸鈉及200 倍濃度的Mg2＋、 Ca2＋、 Na＋和K＋等無機離子對日落黃的檢測沒有明顯影響。

2.5 樣品測定

取市售某飲料5 mL， 以PBS(pH ＝2.5)溶液定容至50 mL， 通過DPV 測量， 未檢出日落黃。為了評估該方法的準確性， 在溶液中添加日落黃進行加標回收實驗， 平行測試6 組。 日落黃添加量為4.00 μmol/L， 平均回收值為3.97 μmol/L，回收率為99.3% ， RSD 為4.4%， 表明該方法重現(xiàn)性好， 可應(yīng)用于測定食品中日落黃的含量。

3 結(jié)論

采用共混法制備GO-CS 復(fù)合溶液， 然后用滴涂法制備了修飾電極: GO-CS/GCE， 并將之應(yīng)用于日落黃溶液濃度的測定。 通過對實驗條件進行優(yōu)化， 獲得了測定的最佳條件， 并采用DPV 研究了日落黃在該修飾電極上的電化學行為， 日落黃溶液濃度在1×10-7～3×10-5mol/L時， 峰電流與日落黃濃度呈線性關(guān)系， 檢出限為8.4×10-8mol/L。 該修飾電極制備方法簡單、 穩(wěn)定性好， 有望在實際應(yīng)用中快速、 靈敏地測定食品中日落黃含量。