王方晗,王 雷,孫婷婷,董志軍,3*

(1.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站，山東 煙臺 264003；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)中心，山東 青島 266071)

被稱為“海洋之肺”的珊瑚礁系統(tǒng)是已知的生物多樣性最高的海洋生態(tài)系統(tǒng)，由多個相互依存的生物群落和珊瑚礁生境組成[1]，具有極高的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值。浮游動物作為次級生產(chǎn)力的重要組成部分，在珊瑚礁系統(tǒng)功能、食物網(wǎng)動力學(xué)、生物地球化學(xué)循環(huán)和漁業(yè)資源補充等方面都起著至關(guān)重要的作用[2-4]。同時，浮游動物對酸化、低氧、升溫等海水環(huán)境變化以及重金屬、抗生素等人工污染物干擾十分敏感[5-6]，其種類組成和群落結(jié)構(gòu)可作為評估珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)質(zhì)量和健康狀況的重要指標(biāo)[7-8]。

浮游動物多樣性的研究依賴于物種的準(zhǔn)確鑒定，傳統(tǒng)方法為利用光學(xué)技術(shù)根據(jù)形態(tài)特征進行鑒定，耗時較長且需要專業(yè)的分類學(xué)知識。同時個體微小、豐度極低的物種易被忽視，形態(tài)十分相似的不同物種也難以區(qū)分，具有一定的局限性[9]，難以滿足現(xiàn)代化海洋生態(tài)監(jiān)測與保護自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的需求[10]。基于第二代測序 (next-generation sequencing,NGS)的宏條形碼技術(shù)能夠更為準(zhǔn)確、快速地檢測環(huán)境樣本中的物種組成及豐度，目前已廣泛應(yīng)用于生物多樣性監(jiān)測[11]。

宏條形碼技術(shù)通過從樣品中直接提取基因組DNA，利用測序技術(shù)對目標(biāo)物種進行定性或定量分析，常用于物種多樣性鑒定和外來入侵物種的監(jiān)測，在環(huán)境微生物群落分析中得到廣泛應(yīng)用[11]。宏條形碼技術(shù)在真核生物中的應(yīng)用仍處于實驗和分析階段，但用于評估浮游動物等多細胞生物的時空分布特征及多樣性研究的潛力已得到廣泛承認[12]。通過對整個群落樣本的DNA進行測序，宏條形碼技術(shù)能夠在分類學(xué)上復(fù)雜的組合中識別任何生命階段的物種，包括隱存種以及傳統(tǒng)方法易忽視或無法鑒定的物種，顯著提高物種的檢出率[10,13-15]，使物種多樣性鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確。在發(fā)現(xiàn)非本土物種方面，宏條形碼技術(shù)也為脆弱海洋生態(tài)系統(tǒng)中入侵物種的監(jiān)測提供重要信息[14,16]。

采用宏條形碼技術(shù)評估浮游動物多樣性，不僅需要相對完備的已鑒定標(biāo)本參考基因序列庫[14]，還需選擇合適的宏條形碼以保證合適的物種覆蓋度和物種敏感性[17]，以避免大量物種的漏檢或無法有效區(qū)分近源物種。宏條形碼要求足夠多的可變區(qū)域用于物種識別，兩側(cè)則需為保守區(qū)域以正確結(jié)合引物[18]。傳統(tǒng)核糖體18S rRNA基因在無脊椎動物和脊椎動物的屬、科和高級分類群中表現(xiàn)出一致的差異模式[19]，其V9高變區(qū)是海洋真核生物多樣性的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記，并已廣泛用于浮游動物的分析[14,20-22]。目前宏條形碼技術(shù)在浮游動物鑒定的應(yīng)用中仍處于發(fā)展階段，相關(guān)參考數(shù)據(jù)庫仍不完整，因此，在進一步完善參考DNA序列數(shù)據(jù)庫的同時，至少對于代表性樣本，應(yīng)同時進行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，以確保浮游動物物種多樣性鑒定的準(zhǔn)確性。

本研究于2019年5月在西沙群島14個調(diào)查站位 (主要為礁盤外沿和潟湖)采集浮游動物樣品，分別利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法和基于18S V9高通量測序的宏條形碼技術(shù)進行形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定，分析各站位浮游動物的物種組成，探究西沙群島浮游動物物種多樣性及空間分布特征，并從物種組成、豐度、優(yōu)勢種、多樣性指數(shù)等方面對兩種方法進行比較，從而評估宏條形碼技術(shù)在浮游動物物種多樣性監(jiān)測中的應(yīng)用潛力。此外，由于以造礁石珊瑚為食的長棘海星 (Acanthasterplanci)近年來在全球主要分布海域大規(guī)模暴發(fā)，導(dǎo)致大量珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)功能退化、海洋生物多樣性降低等一系列生態(tài)問題[23]，對西沙群島珊瑚礁的健康造成威脅。因此，本研究重點關(guān)注長棘海星的分布與豐度，以期為西沙群島長棘海星的防治提供信息支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年5月14日—22日在西沙群島海域14個站位 (表1)采樣，使用淺水II型浮游生物網(wǎng)，參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》[24]采集樣品。每個站位垂直拖網(wǎng)兩次，獲得兩份浮游動物樣品，一份加入5%(體積分數(shù))甲醛溶液固定用于形態(tài)學(xué)鑒定，另一份用篩絹 (孔徑0.160 mm)將海水過濾后，加入無水乙醇固定用于基于18S V9宏條形碼的分子鑒定。

表1 西沙群島海域浮游動物多樣性調(diào)查站位概況Tab.1 Sampling stations of zooplankton diversity survey in areas of Xisha Islands

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將浮游動物的甲醛保存樣品置于體視顯微鏡(OLYMPUS SZX10)下進行形態(tài)學(xué)鑒定分類和計數(shù)，浮游幼體鑒定至類，其他類別鑒定至種[25]。少數(shù)情況下樣本只能被鑒定至屬或更高的分類水平，在進行統(tǒng)計分析時，無法鑒定到種的類群按一種統(tǒng)計[26]。

1.3 宏條形碼技術(shù)分子鑒定

浮游動物無水乙醇保存樣本經(jīng)同孔徑篩絹過濾除去乙醇后，采用十六烷基三甲基溴化銨 (cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)和十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)方法[27]提取浮游動物樣本的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度后，取適量DNA用無菌水稀釋至1 ng/μl。以稀釋后的DNA為模板，以1391F (GTACACACCGCCCGTC)和EukBr (TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC)[28]為引物對18S V9基因片段進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測與回收后進行文庫構(gòu)建，檢驗合格后的文庫使用NovaSeq 6000上機測序。

從下機數(shù)據(jù)中拆分出各站位樣本數(shù)據(jù)，經(jīng)過拼接[29]、嚴格過濾[30]、質(zhì)量控制[31]及去除嵌合體序列[32]等流程后，獲得最終有效序列。利用Uparse軟件[33]將所有樣本的全部有效序列以97%的一致性聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，以出現(xiàn)頻數(shù)最高的OTU序列為代表性序列，與Silva132數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋 (設(shè)定閾值為0.6～1.0)。由于18S V9引物物種覆蓋度較高，不僅能擴增出浮游動物，還能擴增出大量藻類、真菌及人類基因等[17]，因此需對序列進行篩選，去除注釋為藻類、真菌、細菌、人類基因及未鑒定的序列，僅保留注釋為浮游動物的序列。此外，由于Silva132數(shù)據(jù)庫缺乏浮游動物中常見的一些分類群[34]，為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，將相對豐度較高 (>1‰)的OTUs比對至美國國家生物技術(shù)信息中心 (National Center of Biotechnology Information,NCBI)中的非冗余蛋白庫數(shù)據(jù)庫 (Non-redundant Protein Sequence Database,NR)進行進一步物種注釋，比對結(jié)果只保留序列的覆蓋度大于85%、相似度大于90%的浮游動物注釋結(jié)果[35]。

1.4 統(tǒng)計分析

浮游動物優(yōu)勢種根據(jù)每個種的優(yōu)勢度 (Y)[25]確定，使用R (4.0.2)的Picante包[36]對形態(tài)學(xué)及分子鑒定結(jié)果的浮游動物α多樣性指數(shù)進行計算，包括物種豐度指數(shù) (d)[37]、Shannon多樣性指數(shù) (H′)[37]、Simpson多樣性指數(shù) (D)[38]和物種均勻度指數(shù) (J)[37]，具體計算公式如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

J=H′/Hmax

(5)

式 (1)中：ni為第i種的個體數(shù)目，N為所有種類總個體數(shù)目，fi為該種在各站位中的出現(xiàn)頻率，定義Y值大于0.02的種類為本次調(diào)查的優(yōu)勢種 (每個OUT序列作為一個個體數(shù)目計算)。式 (2)至 (5)中：S為樣品中種類總數(shù)，N為所有種類總個體數(shù)目，Pi為第i種的個體數(shù)目與樣品中的總個體數(shù)目的比值，Hmax為Shannon多樣性指數(shù)的最大值。使用SPSS 25.0 并應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)對兩種鑒定方法獲得的多樣性指數(shù)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 相對豐度

基于形態(tài)學(xué)特征在14個站位浮游動物樣本中共鑒定出浮游動物物種數(shù)目為86種(包括11門、17綱、18目、36科、63種，浮游幼體17類)，其中橈足類種類最多 (40種)，占總物種數(shù)目的46.5%，糠蝦類、毛顎類、水螅水母類、等足類、端足類、漣蟲類、多毛類、雙殼類等種類也有分布。西沙群島各島礁浮游動物豐度分布具有空間差異性，平均密度為707.53±378.34 ind/m3，其中玉琢礁站位的浮游動物密度最高，達1 446.76 ind/m3，西沙洲潟湖站位密度最低，僅為167.89 ind/m3。

通過18S V9引物測序后平均每個站位樣品獲得102 535條序列，經(jīng)過質(zhì)控后平均得到99 885條有效序列，聚類后所有站位樣品共得到3 013個OTUs。在序列數(shù)目與物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目)關(guān)系的稀疏曲線中，物種數(shù)目增加的速度隨序列數(shù)目的急劇升高而逐漸降低，表明各站位的測序量足夠覆蓋大部分種類。將OTUs序列比對至Silva132數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為2 837(94.16%)。為減少可能存在的虛假差異，僅對OTU數(shù)量大于10的序列進行分析[39]，同時去除未鑒定、未分類及注釋為藻類、真菌、細菌、人類基因以及哺乳綱動物的序列后，最終獲得233個浮游動物OTUs(包括22門、46綱、85目、120科、136屬、110種)，其中185個OTUs屬于后生浮游動物，48個OTUs屬于原生浮游動物。

為直觀查看各站位浮游動物樣品在不同分類水平上相對豐度較高的物種及其占比，根據(jù)兩種方法的鑒定結(jié)果，選取每個站位在大部分物種鑒定至的分類水平 (門、綱、目)上相對豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖 (圖1)。結(jié)果表明形態(tài)學(xué)鑒定及18S V9分子鑒定中節(jié)肢動物均在西沙群島生物中占據(jù)主導(dǎo)地位，其在各站位中相對豐度分別為45.29%～88.78%及27.79%～82.84%，除形態(tài)學(xué)鑒定中的雙鞭毛蟲門 (11.54%)及分子鑒定中的毛顎動物門 (13.24%)外，其余門類平均相對豐度均未超過10%。在綱水平上，平均相對豐度最高的均為顎足綱 (形態(tài)學(xué)鑒定中占比63.10%，分子鑒定中占比37.47%)，其次分別為甲藻綱 (形態(tài)學(xué)鑒定均為夜光蟲，11.54%)和軟甲綱 (分子鑒定，21.24%)。哲水蚤目 (25.29%)、劍水蚤目 (16.33%)及鞘口水蚤目 (12.55%)在形態(tài)學(xué)鑒定中占據(jù)主導(dǎo)，而分子鑒定中平均相對豐度較高的目則為哲水蚤目 (30.00%)、糠蝦目 (13.63%)及無橫肌目 (12.98%)。在形態(tài)學(xué)鑒定中占比最高物種為夜光蟲 (Noctilucascintillans，12.30%)，其次為小紡錘水蚤 (Acartianegligens，10.90%)，分子鑒定中則為糠蝦 (Paramesopodopsisrufa，11.80%)和肥胖軟箭蟲 (Flaccisagittaenflata，8.50%)。

圖1 浮游動物樣本在各分類水平上相對豐度前10的物種及其占比Fig.1 Species and their proportion of the top 10 species with relative abundance of taxa in zooplankton samples.

對形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定中相對豐度前10中的共有分類水平 (門、綱、目)進行比較，除刺胞動物門外 (r=0.696，p=0.006)，各分類水平的相對豐度在各取樣站位上并無顯著相關(guān)性，但所有站位的平均相對豐度在門以及綱水平上呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，在目水平上無顯著相關(guān)性 (表2)。

表2 形態(tài)學(xué)和分子鑒定各分類水平上相對豐度前10類別中共有類別的物種數(shù)目及平均相對豐度相關(guān)性分析Tab.2 Species number and correlation analysis of averaged relative abundance in the top 10 groups of the most abundance shared by results of morphological and molecular methods

2.2 浮游動物優(yōu)勢種

根據(jù)每個物種的優(yōu)勢度確定西沙群島調(diào)查海域的浮游動物優(yōu)勢種 (表3)，形態(tài)學(xué)鑒定在調(diào)查島礁區(qū)域發(fā)現(xiàn)夜光蟲、小紡錘水蚤、羽長腹劍水蚤 (Oithonaplumifera)、小擬哲水蚤 (Paracalanusparvus)、麗隆劍水蚤 (Oncaeavenusta)、孔雀麗哲水蚤 (Calocalanuspavo)6個主要優(yōu)勢種；分子鑒定獲得糠蝦、肥胖軟箭蟲、長尾紡錘水蚤 (Acartialongiremis)、泳球水母 (Sphaeronecteshaddocki)、酋婦蟹 (Eriphiidaesp.)、赫氏巨囊蟲 (Megalocercushuxleyi)、孔雀麗哲水蚤、武平頭水蚤 (Candaciaarmata)、長腹劍水蚤 (Oithonasp.)及兩種哲水蚤 (Uncultured Calanoida)共11個優(yōu)勢種。其中，兩種哲水蚤僅鑒定至目，酋婦蟹和長腹劍水蚤僅鑒定至屬。形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定優(yōu)勢種中均含有孔雀麗哲水蚤。此外，不同調(diào)查島嶼的優(yōu)勢種種類也存在差異。

表3 兩種方法鑒定14個站位浮游動物優(yōu)勢種Tab.3 Dominant zooplankton species identified by two methods in 14 stations

續(xù)表

2.3 物種多樣性指數(shù)

形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果的物種多樣性指數(shù)如表4，宏條形碼技術(shù)作為一種半定量鑒定方法，無法獲得準(zhǔn)確的個體密度，因此僅對兩種方法獲得的d、H′、D和J值進行比較。除站位14外，各站位基于分子鑒定的d值均高于基于形態(tài)學(xué)特征鑒定的結(jié)果。大部分站位 (71.4%)基于分子鑒定得到的H′值也均高于形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，但兩者差異較小，只有少數(shù)站位(1、5、10及11)的H′值在兩種鑒定方法之間存在較大的差異。除少數(shù)站位(1、5及8)外，大部分站位基于形態(tài)學(xué)鑒定獲得的D值與分子鑒定的結(jié)果均較為接近，兩種方法的平均D值差異性在3種多樣性指數(shù)中最小。所有站位上基于形態(tài)學(xué)鑒定的J值均高于分子鑒定，且兩者之間存在較大的差異，形態(tài)學(xué)鑒定的平均J值是分子鑒定的1.57倍。

在一致性方面，當(dāng)關(guān)注所有站位時，基于兩種鑒定方法獲得的α多樣性指數(shù)均無顯著的一致性 (表4)。但當(dāng)排除差異較大的少數(shù)站位 (1、5、10、14)后，差異較小的多數(shù)站位 (71.4%)中基于分子鑒定與基于形態(tài)學(xué)鑒定獲得的H′值 (r=0.802，p=0.005)、D值 (r=0.759，p=0.011)及J值 (r=0.664，p=0.036)均呈現(xiàn)出顯著的一致性。

表4 形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定的浮游動物個體密度和α多樣性指數(shù)Tab.4 Species densities and α diversity indexes by morphological and molecular identification

2.4 特殊浮游動物的宏條形碼技術(shù)鑒定

基于長棘海星暴發(fā)對珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的危害性，本研究對西沙群島的調(diào)查重點關(guān)注各采樣站位中長棘海星的分布及豐度。形態(tài)學(xué)鑒定中僅在11號站位中發(fā)現(xiàn)海星羽腕幼體，但無法進一步確定是否為長棘海星。而在分子鑒定中出現(xiàn)注釋為長棘海星的OTUs，共66個，占全部OTU數(shù)量的0.8‰，主要分布于站位4 (中島)，在其他5個調(diào)查站位 (3、7、8、9、10)也有少量出現(xiàn) (OTU數(shù)量<10)。

在極微小生物的檢測中，宏條形碼技術(shù)也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，檢測出48種原生動物OTUs，分別屬于8門，16綱，23目，而形態(tài)學(xué)鑒定僅檢測出夜光蟲及有孔蟲兩種原生動物。

2.5 討論

2.5.1 浮游動物多樣性 本研究通過形態(tài)學(xué)鑒定和基于18S V9的分子鑒定兩種方法，對比研究了西沙群島調(diào)查海域的浮游動物多樣性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)本次調(diào)查海域浮游動物主要種類包括橈足類、軟甲綱和箭蟲綱，這3個類別的物種在兩種鑒定方法中均具有較高的相對豐度。此外，形態(tài)學(xué)鑒定中原生動物夜光蟲 (12.30%)的相對豐度最高，而分子鑒定的軟甲綱動物糠蝦 (11.75%)最高。形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定獲得的大部分優(yōu)勢種均為橈足類，這與其他西沙群島浮游動物多樣性調(diào)查結(jié)果一致[1,40]。其中形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定共同檢出孔雀麗哲水蚤，分子鑒定獲得的優(yōu)勢種中含有兩種未鑒定至種的哲水蚤，可能包含在形態(tài)學(xué)方法鑒定出的優(yōu)勢種之中。由于采樣島嶼之間距離較遠，不同調(diào)查站位的優(yōu)勢種種類存在差異；不同方法鑒定出的各站位優(yōu)勢種也存在差異，可能是實驗過程中樣本分配或擴增過程中產(chǎn)生的誤差所致[41]。不同站位的浮游動物豐度具有差異性，一般礁盤外沿浮游動物豐度較高，而潟湖區(qū)域由于無珊瑚礁覆蓋，生態(tài)系統(tǒng)較為簡單，浮游動物豐度相對較低。其中，玉琢礁附近海域浮游動物豐度最高，西沙洲潟湖豐度最低。各站位浮游動物平均密度為707.53 ind/m3，總體上調(diào)查海域浮游動物豐度較低，符合熱帶珊瑚礁海域寡營養(yǎng)鹽的生境特征。

2.5.2 長棘海星分布與豐度 近年來長棘海星的暴發(fā)對珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)造成巨大威脅，李元超等 (2019)通過對2005—2019年間西沙群島主要島礁的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)進行監(jiān)測，認為西沙群島海域長棘海星的暴發(fā)頻率為每15年1次，目前正進入下一個長棘海星暴發(fā)周期，為避免珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)遭受嚴重破壞，應(yīng)對長棘海星種群動態(tài)進行監(jiān)控和預(yù)測，及時采取措施積極應(yīng)對[42]。本次對西沙島礁浮游動物樣品的形態(tài)學(xué)鑒定中僅在玉琢礁樣本中發(fā)現(xiàn)海星羽腕幼體，且無法進一步確定是否為長棘海星，但利用宏條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)長棘海星在七連嶼海域北島、中島、趙述島、西沙洲均有檢測到，主要集中在中島，雖然OTU數(shù)目較少 (僅占全部OTU數(shù)量的0.8‰)，但仍對該區(qū)域珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)具有較大的威脅。

2.5.3 兩種鑒定方法比較 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時長、效率低，且需要專業(yè)的分類學(xué)背景。而DNA 宏條形碼技術(shù)通過高通量測序和數(shù)據(jù)庫比對，可實現(xiàn)大規(guī)模樣本的批量鑒定，能夠全面、快速評估物種多樣性，目前已廣泛用于多種生態(tài)系統(tǒng)中浮游動物多樣性的鑒定[13-14,43-44]。在大多數(shù)情況下，使用宏條形碼鑒定方法獲得的特定分類群物種的相對豐度與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果呈現(xiàn)顯著相關(guān)性[6,14]，本研究中使用兩種方法對西沙群島浮游動物多樣性進行鑒定時，相對豐度最高的類別均為橈足類，大部分優(yōu)勢種類均為哲水蚤目，且在對兩種鑒定結(jié)果進行α多樣性指數(shù)分析時，分子鑒定的H′、D、J值在大部分站位與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性。研究結(jié)果表明，宏條形碼技術(shù)的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)等鑒定方法有較強的一致性，前者有希望成為浮游動物物種多樣性鑒定的高通量方法。

2.5.4 宏條形碼技術(shù)在浮游動物多樣性鑒定中的優(yōu)勢 由于海洋生物物種數(shù)量龐大、樣品保存條件限制等，精確分類對海洋生物分類學(xué)家的分類鑒定水平具有很高要求。宏條形碼技術(shù)對觀察者的依賴性較小，使不同研究組產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集之間的比較更為準(zhǔn)確。雖然目前的參考數(shù)據(jù)庫仍不完整，但也隨時可以根據(jù)更新的參考數(shù)據(jù)庫快速進行重新鑒定，這一優(yōu)勢在海洋生物多樣性的長期監(jiān)測中或年際變化研究中具有良好的應(yīng)用前景[21,39]。使用宏條形碼技術(shù)還可檢測出相對豐度極低或傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定無法檢出或精確分類的物種，如本研究中長棘海星在分子鑒定中檢測到，而顯微鏡下經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定僅能分類至海星羽腕幼體，無法確定是否為長棘海星，表明宏條形碼在生物入侵[16,22]或相對豐度極低的物種如暗礁隱秘物種[45]的檢測上也具有巨大的應(yīng)用潛力。同時極微小生物如大部分原生生物在顯微鏡檢時可能會被忽略，造成多樣性的低估，而基于宏條形碼分析的分子鑒定則能夠有效避免這一問題。

2.5.5 宏條形碼技術(shù)在浮游動物鑒定中的問題及優(yōu)化方案 宏條形碼對物種的精確鑒定依賴于引物的精心設(shè)計，18S V9引物物種覆蓋度更高，但物種識別敏感性較差[17]，難以識別至種水平，本研究中僅有47.21%的浮游動物OTUs注釋至種水平，優(yōu)勢種中還存在兩種僅注釋至目水平，表明18S V9引物在浮游動物物種水平多樣性監(jiān)測上仍存在一些限制。目前常用于浮游動物多樣性鑒定的另一基因——線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ (cytochrome c oxidase Ⅰ,COⅠ)則專門針對后生浮游動物設(shè)計[46]，在浮游動物中具有更高的物種分辨率，但由于該基因在物種間具有較大的序列變異，因此難以在更廣的分類單元上設(shè)計出適合的通用引物[47-48]，極大限制了其在浮游動物宏條形碼鑒定中的應(yīng)用。退化COⅠ引物、多標(biāo)記、多引物對的使用可顯著提高物種多樣性鑒定的準(zhǔn)確性[49]。除引物外，在基于閾值和聚類的方法中，閾值的選擇也會顯著影響物種識別的準(zhǔn)確性，并導(dǎo)致對生物多樣性的低估或高估[13,50]；數(shù)據(jù)庫的不完整也極大地限制了宏條形碼鑒定的應(yīng)用，本研究中分子鑒定獲得的少數(shù)高豐度OTU序列以及部分豐度較低的序列在數(shù)據(jù)庫中并無覆蓋度和相似度滿足要求的注釋物種，或在數(shù)據(jù)庫中僅以未鑒定或未分類真核生物樣本形式存在，極大地降低了對浮游動物多樣性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過構(gòu)建本地DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，對通用數(shù)據(jù)庫進行補充，則可有效緩解這一限制[10,43]。其他可能導(dǎo)致鑒定結(jié)果產(chǎn)生假陰性 (樣本中存在物種但未檢測到)和假陽性 (物種被檢測但不存在)的技術(shù)限制也在不斷進行探究與優(yōu)化，如優(yōu)化DNA提取[51]和PCR擴增方法[46]、采用PCRfree建庫處理擴增錯誤和測序偽影[52]、開發(fā)高質(zhì)量的參考序列數(shù)據(jù)庫、選擇合適的生物信息學(xué)步驟來適應(yīng)物種間可變的序列差異閾值[50]以及改進現(xiàn)有軟件或開發(fā)新軟件等。

盡管宏條形碼分析對物種水平以上的分類群相對豐度的量化已被證明與形態(tài)學(xué)分析相吻合，但與形態(tài)學(xué)分析中的物種豐度數(shù)據(jù)并沒有很好的一致性，在多拷貝基因問題解決之前，宏條形碼仍是生物多樣性分析的半定量方法[42,53]。群落生物多樣性分析中分類群的豐度或相對豐度仍需進行準(zhǔn)確量化，以便對群落特征和許多生物學(xué)指標(biāo)進行評估，且由于宏條形碼技術(shù)無法反應(yīng)生物的生長階段，目前浮游動物多樣性監(jiān)測仍以形態(tài)學(xué)鑒定為主。而宏條形碼技術(shù)效率高、成本低且能夠有效彌補形態(tài)學(xué)鑒定法的某些缺陷，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展完善，在未來有望成為一種補充甚至替代現(xiàn)有物種多樣性評估的技術(shù)體系。

3 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)方法和基于18S V9測序的宏條形碼技術(shù)，對西沙群島14個調(diào)查站位的浮游動物樣本生物多樣性進行鑒定。結(jié)果表明，此次調(diào)查海域浮游動物樣本主要種類包括橈足類、軟甲綱和箭蟲綱，這3個類別的物種在兩種鑒定方法中均具有較高的相對豐度。由于調(diào)查站位距離較遠，各站位浮游動物物種豐度、組成及優(yōu)勢種存在差異，總體符合熱帶珊瑚礁海域的生境特征。與形態(tài)學(xué)鑒定相比，基于18S V9測序的宏條形碼技術(shù)鑒定具有更高的物種覆蓋度，且代表性類群的相對豐度和多樣性指數(shù)在大部分站位與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性，表明宏條形碼技術(shù)在我國海洋浮游動物物種多樣性評估中具有較好的應(yīng)用前景。