李振宇，尹華群，邵宗澤，王萬鵬*

(1.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙410012；2.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005)

石油是工業(yè)的血脈，但泄漏的石油對(duì)特定環(huán)境而言往往意味著極大的危害[1]。當(dāng)石油烴侵入海洋環(huán)境時(shí)，海面上會(huì)形成一層不均勻的薄膜，該膜會(huì)擾亂正常的海洋大氣、能量和水交換，抑制光合作用[2]，進(jìn)入食物鏈的烴更對(duì)海洋生物造成持續(xù)的毒性影響[3-5]，并進(jìn)一步危害人類健康。盡管海洋表層的一部分石油烴可以通過蒸發(fā)、光化學(xué)效應(yīng)、微生物分解等一系列物理、化學(xué)和生物過程進(jìn)入大氣，但大部分仍以溶解組分或相應(yīng)降解組分的形式存在于海洋環(huán)境中，它們中的一些組分還通過吸附、絮凝、沉淀等作用進(jìn)入沉積物，在深海形成石油烴的聚集體[6-7]。PAHs是石油烴的主要有害成分，不僅具有極強(qiáng)的致癌、致畸和致突變作用，對(duì)人類健康存在巨大威脅[8]，它們復(fù)雜而穩(wěn)定的芳香結(jié)構(gòu)、高共振能量和有限的生物利用度使它們具有化學(xué)穩(wěn)定性和抗微生物降解的能力[9]。在海平面2 000 m以下的海洋環(huán)境中，黑暗、高壓、高鹽、低氧和低溫營造了獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，與陸地和淡水環(huán)境相比，從深海環(huán)境中能夠發(fā)現(xiàn)并獲得更多的新型石油烴降解功能菌株，有力推動(dòng)烴降解基礎(chǔ)理論研究和微生物環(huán)境修復(fù)應(yīng)用前行。

近年來嗜鹽菌大量應(yīng)用于污水類生物修復(fù)，嗜鹽菌降解烴的研究也引起廣泛關(guān)注。鹽單胞菌屬(Halomonas)是嗜鹽菌的重要組成部分，屬于革蘭氏陰性菌，迄今發(fā)現(xiàn)有一百多個(gè)種，種群龐大，功能多樣。其中一部分種類被認(rèn)為在生物修復(fù)技術(shù)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)樗鼈兙哂挟a(chǎn)生水溶性的細(xì)胞外多糖、乳化劑或氧化酶的能力，它們是自然界降解污染物(芳香族化合物)的重要組成，如變異鹽單胞菌HalomonasvariabilisW10[10]、鹽單胞菌HalomonasanticariensisFP35[11]、沙漠鹽單胞菌HalomonasdesertisG11[12]、鹽單胞菌Halomonassp.KHS3[13]和Halomonassp.TG39a[14]等，但鮮有關(guān)于鹽單胞菌株厭氧烴降解功能的報(bào)道。厭氧烴降解菌在環(huán)境污染生物修復(fù)中有重要的應(yīng)用前景，因?yàn)楹芏嘤臀廴就寥琅c廢水是厭氧環(huán)境。雖然其在油污治理過程中有特殊的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)厭氧烴降解菌的研究相對(duì)較少。深海沉積物往往是厭氧的寡營養(yǎng)環(huán)境，但多環(huán)芳烴等難降解有機(jī)物隨“海雪”及顆粒沉積進(jìn)入深海沉積物，也為微生物生長提供了難得的碳源與能源[15]。因此，本研究從太平洋沉積物中選取深層沉積物，進(jìn)行厭氧烴富集：以混合PAHs為唯一碳源，在避光、高鹽、20 ℃，常壓下靜置培養(yǎng)；通過傳代培養(yǎng)，分析其中烴代謝群落的變化，以期分離出高效新型的烴降解功能菌株。

本研究主要采用厭氧培養(yǎng)方法，結(jié)合高通量測序技術(shù)，以期揭示深海沉積物經(jīng)厭氧PAHs富集后的主要細(xì)菌群落組成，并對(duì)深海來源的厭氧烴降解菌群進(jìn)一步了解。通過分離純化獲得群落中的烴降解菌株P(guān)A16-9，基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析表明該菌歸屬于泰坦尼克鹽單胞菌(Halomonastitanicae)。已知該菌屬具有好氧降解單環(huán)芳烴和萘的能力，但沒有相關(guān)報(bào)道其厭氧降解高分子量多環(huán)芳烴(HMW-PAHs)能力。

1 材料和方法

1.1 沉積物樣品來源

本實(shí)驗(yàn)采用由“向陽紅03”號(hào)科考船2017年執(zhí)行環(huán)球科考任務(wù)期間，在多個(gè)太平洋站點(diǎn)(表1)經(jīng)電視抓斗采樣器采集的深海沉積物，沉積物為黃褐色，無味，弱黏性，表層呈半流動(dòng)狀，手搓略有粉砂感，向下稠度增加，10 cm以下富含黃白色團(tuán)塊混雜。沉積物樣品經(jīng)無菌收集后，于低溫保存運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一階段研究。

1.2 厭氧富集

采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MSM)進(jìn)行富集，通過鹽度調(diào)整模擬海水環(huán)境，成分組成包括：氯化銨0.33 g/L，硝酸鈉0.88 g/L，氯化鉀0.5 g/L，無水氯化鈣0.5 g/L，氯化鎂(7H2O)3.0 g/L，氯化鈉22.0 g/L，無水硫酸鈉3.0 g/L，PIPEs(哌嗪-1,4-二乙磺酸)緩沖液5.0 g/L，培養(yǎng)基中加入1 mL/L的刃天青溶液(1.0 g/L)作為氧氣指示劑，pH調(diào)至6.8，培養(yǎng)基清澈不渾濁；另配置常用的微量元素溶液、維生素溶液和5%的磷酸鹽溶液，過濾除菌備用。選用二甲基亞砜(DSMO)溶解PAHs配置成碳源母液，過濾除菌備用。

取150 mL規(guī)格厭氧瓶，洗凈后加入100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，通純氮?dú)獬堄嗫臻g的氧氣。膠塞封口加鋁蓋，121 ℃高溫滅菌20 min，待體系冷卻至室溫后，在超凈工作臺(tái)通過注射器補(bǔ)加微量元素溶液、維生素溶液、磷酸鹽溶液和碳源(混合芳烴及烷烴)等(表1)。取出前述沉積物樣品，按比例(1∶100)使無菌MSM溶液與沉積物樣品形成濁液，通過注射器注入密封的厭氧培養(yǎng)基中。室溫下避光靜置培養(yǎng)4周后，進(jìn)行稀釋，抽取富集物添加到新的培養(yǎng)基中(1∶10)。

除氧：將培養(yǎng)基配置完畢，添加氧氣指示劑刃天青，原無色培養(yǎng)基顯藍(lán)色。加熱培養(yǎng)基至沸騰，導(dǎo)氣管伸入液面下，通純氮?dú)獬テ恐醒鯕?，同時(shí)添加半胱氨酸鹽酸鹽或硫化鈉，除去液體中殘余的氧氣。通氣約10 min左右，另取一導(dǎo)氣管置于空培育瓶中通氮?dú)?約1 min)，目的是排盡瓶中氧氣。采用移液器深入培養(yǎng)基深層移取培養(yǎng)基至空培養(yǎng)瓶中，隨后加蓋橡膠塞的過程中抽出導(dǎo)氣管，最后加蓋鋁蓋。移液分裝的過程中應(yīng)保持培養(yǎng)基處于通氣除氧的狀態(tài)。全部分裝完畢后，121 ℃下滅菌20 min，培養(yǎng)基呈現(xiàn)無色狀態(tài)，表示培養(yǎng)瓶中為無氧環(huán)境。若實(shí)驗(yàn)中厭氧瓶重新進(jìn)氧，則培養(yǎng)基呈現(xiàn)粉紅色，可通過添加少量半胱氨酸鹽酸鹽溶液進(jìn)行除氧。

1.3 富集菌群的DNA提取、高通量測序和細(xì)菌多樣性分析

對(duì)深海沉積物樣品采用合理的厭氧富集策略，獲得厭氧富集物，用0.22 μm的濾膜過濾收集菌體，采用美國MO BIO公司的水樣基因組提取試劑盒(14900-100-NF，PowerWater? DNA 分離試劑盒)提取樣品總DNA，在1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳下檢測到明亮DNA條帶，并通過Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測DNA濃度，-80 ℃保存。采用細(xì)菌引物338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，PCR擴(kuò)增16S rRNA的V3～V4區(qū)。

使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq試劑盒建庫，然后接頭連接，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集，磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫，采用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。將原始數(shù)據(jù)拼接、過濾，對(duì)其作標(biāo)準(zhǔn)均一化處理和多樣性分析[16]：基于有效數(shù)據(jù)將相似性達(dá)97%的序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類。采用RDP classifier貝葉斯算法[17]對(duì)97%相似水平的OTU代表序列作分類學(xué)分析。

1.4 厭氧平板分離

將低溫瓊脂添加至MSM培養(yǎng)基中，高溫滅菌后溫度下降至50 ℃左右時(shí)，添加微量元素溶液、維生素溶液、磷酸鹽溶液和碳源(混合PAHs及烷烴)等，在厭氧操作箱中倒平板，待厭氧平板凝固后備用。通過注射器抽取10～20 μL厭氧富集物，在厭氧操作箱中均勻涂布在厭氧平板上，通過厭氧罐或一次性厭氧袋取出，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3周后，觀察厭氧平板上菌株生長狀況。通過厭氧平板劃線純化，獲得平板上的生長菌株。

1.5 16S rRNA遺傳分析

培養(yǎng)目標(biāo)菌株生長至對(duì)數(shù)期，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(硅膠柱型)提取目標(biāo)菌株的基因組DNA，置于-20 ℃存放備用。通過引物27F、1492R擴(kuò)增16S rRNA基因，將送測獲得的序列，提交至EzBioCloud進(jìn)行目標(biāo)序列與數(shù)據(jù)庫的比對(duì)[18]，鑒定分離菌株的種屬。通過IMNGS (https://www.imngs.org/)對(duì)該菌序列來源進(jìn)行比對(duì)分析，整理并分析來源區(qū)域特性。

1.6 PAHs降解率測定

以芘為唯一碳源(初始質(zhì)量濃度50 mg/L)，硝酸鹽為唯一電子受體(初始濃度10 mmol/L)，測定菌株P(guān)A16-9對(duì)芘的厭氧降解率。芘含量的測定方法如下：每個(gè)時(shí)間段設(shè)置3個(gè)平行，取樣時(shí)間為1、7、14、30、46 d。通過正己烷萃取培養(yǎng)液中的芘，旋蒸后收集濃縮液，氮吹定容至1 mL。取1 mL樣品稀釋500倍，取2 mL稀釋液經(jīng)0.45 μm孔徑聚酰胺微孔濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至2 mL色譜瓶上機(jī)進(jìn)行GC-MS檢測，進(jìn)樣量為1 μL。

色譜條件包括：載氣為高純氦氣；柱溫60 ℃，以10 ℃/min的速度升到280 ℃，維持5 min；分流比3∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱流速1.3 mL/min；檢測器溫度250 ℃；掃描范圍40～400 amv；電子能量70 ev；載氣流速1 mL/min；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；選擇定量分析SIM掃描模式，分別掃描相應(yīng)PAH的特征離子碎片。

1.7 亞硝酸鹽濃度測定

本研究使用重氮-偶氮法[19]測定菌體及培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧富集物細(xì)菌多樣性

實(shí)驗(yàn)采用混合PAHs碳源作為厭氧富集的唯一碳源，深海沉積物樣品經(jīng)過富集和傳代4、6、12周。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)提取各個(gè)階段厭氧烴富集物DNA，送測微生物群落多樣性后獲得各個(gè)階段的微生物相對(duì)豐度和群落結(jié)構(gòu)組成?；贠TU聚類結(jié)果，我們對(duì)樣本的α-多樣性進(jìn)行分析。α-多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有Sobs、Shannon、Ace、Simpson和Chao等，我們通過比較各種指數(shù)值進(jìn)而得到物種的多樣性豐度等信息。不同樣品中厭氧烴降解群落的種類豐度具有較大差異，T6分組的X6樣品呈現(xiàn)出最高的Shannon指數(shù)，該樣品的群落組成的均一度也最為復(fù)雜(圖1)。稀釋性曲線分析表明，隨著測序讀取序列數(shù)量的增加，樣品α-多樣性沒有顯著變化，表明該測序量已經(jīng)能夠較為精確的反映樣品中的群落相對(duì)豐度。將各樣品Reads數(shù)均一化處理，在相同水平進(jìn)行多樣性比較。

圖1 厭氧烴富集物細(xì)菌序列稀釋性曲線Fig.1 Sequential dilution curve of anaerobic hydrocarbon enrichment bacteria

在屬水平上觀察不同樣品在經(jīng)厭氧烴富集獲得的厭氧烴代謝菌落組成差異。在4個(gè)沉積物樣品的厭氧烴富集群落中，共有320個(gè)屬被發(fā)現(xiàn)，T3系列富集物樣品測得111個(gè)屬，T5系列樣品測得160個(gè)屬，T6系列樣品測得220個(gè)屬，T8系列樣品測得203個(gè)屬，其中59個(gè)菌屬是4組富集物中所共有的，這類共有菌屬均在樣品中占較高豐富度(圖2)。通過分析我們發(fā)現(xiàn)，這些主要類群的菌屬包括鹽單胞菌屬(Halomonas)、海旋菌屬(Thalassospira)、海桿菌屬(Marinobacter)、海洋桿菌屬(Oceanobacter)和食烷菌屬(Alcanivorax)等。已有研究表明這些占主要類群的菌株在好氧條件下具有烴降解能力，在厭氧條件下沒有相關(guān)報(bào)道。其中鹽單胞菌屬是海洋中常見的兼性厭氧細(xì)菌，在大多數(shù)樣品中的占比最高。

圖2 屬水平上不同樣品富集的細(xì)菌類群差異Fig.2 Differences in bacterial groups enriched in different samples at the genus level

在厭氧條件下，初代富集物和傳代富集物的高通量測序結(jié)果表明(圖3)，鹽單胞菌屬在絕大多數(shù)培養(yǎng)物中占主要豐度。而海旋菌屬在M8、N8、X8富集物中占主要的豐度。富集之間的傳遞表明微生物群落具有顯著的遺傳。M3、N3、X3富集物中，鹽單胞菌屬的相對(duì)豐度呈梯度增加，分別為90.04%、98.52%、99.15%。在經(jīng)過4周厭氧富集培養(yǎng)的初代培養(yǎng)物M3、M5、M8中，食烷菌屬的相對(duì)豐度分別為1.90%，16.88%、1.58%。但是在隨后的傳代培養(yǎng)物中，食烷菌屬的豐度逐漸下降并消失了。T8系列多樣性從第一代(M8)到第二代(N8)下降了，但到了第三代(X8)則增加了。在M5、N5、X5和M6、N6、X6的組中也發(fā)生了此現(xiàn)象。盡管在M6和N6培養(yǎng)物中，鹽單胞菌屬的相對(duì)豐度高于97%，但在隨后的第三代傳代培養(yǎng)物X6中觀察到了相對(duì)均勻分布的群落豐度和較高的群落多樣性，主要類群有Ruminococcaceae (19.28%)、Subdoligranulum(15.67%)、Collinsella(11.11%)、Blautia(8.69%)、Halomonas(6.58%)、Erysipelatoclostridium(6.43%)、Streptococcus(5.52%)等。一個(gè)合理的猜想就是第三代富集的時(shí)間相對(duì)較長，微生物群落經(jīng)過相互競爭新的生態(tài)位，演化形成新格局。由于高鹽和低氧富集條件，大多數(shù)微生物極可能屬于具有烴脅迫的機(jī)會(huì)主義者。生命的目的在于延續(xù)，當(dāng)微生物在競爭中處于不利位置時(shí)，將進(jìn)行類似休眠的生命活動(dòng)。當(dāng)進(jìn)入新環(huán)境時(shí)(傳代)，它們將開始新一輪的生態(tài)位競爭。因此，第三代培養(yǎng)物X6呈現(xiàn)出較高的的微生物群落多樣性。

圖3 厭氧烴富集物中的細(xì)菌群落組成(屬)Fig.3 Bacterial community composition (genus)in anaerobic hydrocarbon enrichment

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)深海沉積物進(jìn)行厭氧混合烴富集后，取適量富集物涂布至厭氧平板上，厭氧(微氧)平板也以混合烴為唯一碳源，生長4周左右形成大小不一的褐色菌落(長時(shí)間后菌落外形成水膜)，挑取菌落接種至厭氧液體培養(yǎng)基避光培養(yǎng)。

從富集的沉積物中分離出的PA16-9菌株，能夠降解多種烴類物質(zhì)。提取菌株的基因組DNA后，使用引物27F和1492R擴(kuò)增其16S rRNA基因。在EzBioCloud和NCBI網(wǎng)站上選擇與其16S rRNA高度相似的序列，使用MEGA-X計(jì)算序列的系統(tǒng)發(fā)生距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-Joining)。該菌株的16S rRNA序列在分類上歸屬于Gammaproteobacteria、Oceanospirillales、Halomonadaceae，與模式菌株泰坦尼克鹽單胞菌HalomonastitanicaeBH1T高度相似，具有99.52%的相似性(圖4)，并在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成了一個(gè)共同分支，因此命名為HalomonastitanicaePA16-9。

圖4 菌株P(guān)A16-9系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic analysis of strain PA16-9

基于HalomonastitanicaeBH1T的16S rRNA基因序列，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列檢索的不完全統(tǒng)計(jì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該類群的菌株廣泛存在于自然界的水圈和土壤，以及相關(guān)的工業(yè)發(fā)酵場所，涉及的主要生境包括海灘、廢水、活性污泥、油田、濕地等，在較為極端的環(huán)境如極地、熱泉、高鹽湖等地均有發(fā)現(xiàn)，說明該菌在復(fù)雜環(huán)境的生物修復(fù)應(yīng)用中具有很大潛力。

2.3 烴降解能力

將PA16-9單菌落劃線接種至高鹽LB固體平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，32 ℃培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形，米黃色半透明，表面光滑濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央微凸起，直徑2～4 mm。PA16-9為革蘭氏陰性菌，兼性好氧。取初生菌體制片，進(jìn)行透射電鏡觀察，呈桿狀，長度為1.6～2.0 μm，外圍有菌毛，主要依賴鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)[圖5(a)]。

以芘為唯一碳源，在好氧和厭氧條件下分別培養(yǎng)菌株P(guān)A16-9至對(duì)數(shù)生長期。收集菌體與芘顆粒，做掃描電鏡觀察，可見芘顆粒的光滑表面與菌株粗糙的菌落表面形成反差。在厭氧條件下，5 μm尺度下可以清晰地觀察到菌株P(guān)A16-9呈長桿狀整齊排列[圖5(b)]；在好氧條件下，菌株含量相對(duì)較高，產(chǎn)生的胞外物質(zhì)呈現(xiàn)黏稠狀，只能觀察到粗糙的菌落表面[圖5(c)]。芘顆粒在掃描電鏡下呈現(xiàn)晶體狀，不過在菌株作用前后并未見明顯的表面裂縫，僅表面有菌株分泌物附著。在好氧搖瓶中能明顯觀察到芘顆粒經(jīng)菌株作用后呈稠狀。

圖5 菌株P(guān)A16-9的形態(tài)Fig.5 Morphology of strain PA16-9(a)透射電鏡，(b)掃描電鏡(厭氧，芘為唯一碳源)，(c)掃描電鏡(好氧，芘為唯一碳源)。

通過厭氧瓶的封閉式培養(yǎng)營造厭氧環(huán)境，以芘、苯并芘和正十六烷分別為唯一碳源，設(shè)一組無碳源對(duì)照組，28 ℃避光條件下，置于搖床培養(yǎng)以促進(jìn)菌株與底物間的接觸。接菌后培養(yǎng)半天，搖勻取樣鏡檢、血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)得初始菌株含量約為5×107個(gè)/mL，培養(yǎng)期間為避免多次取樣引起進(jìn)氧，僅取少量樣品用以判定菌株生長狀況，18 d后通過顯微鏡計(jì)數(shù)，觀察到芘和正十六烷為碳源的樣品中菌株生長不太明顯，菌株含量略有升高；在以苯并芘為唯一碳源的樣品中，菌株大量生長，菌株含量達(dá)到2×108個(gè)/mL，相比于接種時(shí)顯著增高；無碳源培養(yǎng)基菌株含量變化不大[圖6(a)]，鑒于鹽單胞菌屬適應(yīng)于海洋這類營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的環(huán)境，可能具有一些特殊的代謝途徑在無碳環(huán)境中存活一段時(shí)間。

以芘為唯一碳源(初始含量50 mg/L)，硝酸鹽為唯一電子受體(初始濃度10 mmol/L)，在厭氧條件下測定芘的降解率和亞硝酸鹽積累量，設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)45 d后芘的降解率達(dá)到61.9%，期間亞硝酸鹽逐漸積累，濃度約為0.24 mmol/L[圖6(b)]。在厭氧培養(yǎng)過程中，硝酸鹽作為電子受體，烴作為電子供體，硝酸鹽經(jīng)反硝化過程被還原到亞硝酸鹽，研究普遍認(rèn)為過高的亞硝酸鹽濃度會(huì)抑制菌株生長。在以苯并芘為唯一碳源時(shí)，培養(yǎng)50 d后亞硝酸鹽積累量達(dá)到近1 mmol/L，菌株依舊保持較高活性。但是以非烴的堿性木質(zhì)素作為唯一碳源時(shí)，培養(yǎng)后期測得亞硝酸鹽積累量高達(dá)8 mmol/L，菌株活性處于很低的狀態(tài)，顯然是過高的亞硝酸鹽抑制了菌株活性(數(shù)據(jù)未展示)。當(dāng)以亞硝酸鹽作為唯一電子受體時(shí)，控制初始濃度在1 mmol/L以下，菌株生長緩慢，猜想是由于亞硝酸鹽作為電子受體的濃度相對(duì)較低，從而影響菌株P(guān)A16-9厭氧條件利用烴(芘)的效率。

圖6 菌株P(guān)A16-9厭氧生長與芘的降解率Fig.6 Anaerobic growth of strain PA16-9 and degradation rate of pyrene(a)菌株P(guān)A16-9在不同條件下厭氧生長18 d后的情況，(b)厭氧條件下菌株P(guān)A16-9對(duì)芘的降解率和亞硝酸鹽積累量。

2.4 討論

厭氧烴降解菌在環(huán)境污染生物修復(fù)中有重要的應(yīng)用前景，因?yàn)楹芏嘤臀廴就寥琅c廢水是厭氧環(huán)境。該類菌在石油污染治理過程中有特殊的應(yīng)用價(jià)值，然而對(duì)厭氧烴降解菌的研究相對(duì)較少。鹽單胞菌廣泛分布在海洋、高鹽湖、鹽堿地等環(huán)境中，關(guān)于鹽單胞菌的好氧烴降解能力已有大量研究。從受烴污染區(qū)域分離得到的鹽單胞菌包括從墨西哥灣“深水地平線”溢油地點(diǎn)獲得的鹽單胞菌Halomonassp.19A、從法國南部地區(qū)一個(gè)污染的港口分離得到的Halomonassp.A3H3[20]，以及從馬德普拉塔港分離獲得的烴降解菌Halomonassp.KHS3[13,21]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明，它們都具有良好的好氧烴降解能力。

菌株P(guān)A16-9分離自太平洋深海沉積物的PAHs厭氧富集菌群，菌群結(jié)構(gòu)分析表明鹽單胞菌屬為富集菌群的最優(yōu)勢菌屬。分離得到的海旋菌和食烷菌屬的菌株，在厭氧條件下生長均受到明顯抑制。僅鹽單胞菌能夠在以萘、菲、芘、苯并(a)芘等PAHs和正十六烷為唯一碳源的條件下厭氧生長，其中以苯并(a)芘做碳源時(shí)菌株生長尤為顯著，具有廣譜的烴厭氧降解能力。因此推測菌株P(guān)A16-9的烴降解功能實(shí)際是一種群體功能，單個(gè)菌株對(duì)烴類外源物質(zhì)具有感應(yīng)、耐受等能力，僅當(dāng)形成龐大數(shù)量構(gòu)成的菌群時(shí)，才具有高效的烴降解能力。以往研究表明，在PAHs與簡單碳源一同添加時(shí)，微生物對(duì)PAHs的降解效率得到提高[22]。研究認(rèn)為純菌降解PAHs的效率低于它們?cè)谌郝渲械男剩才囵B(yǎng)中更高的降解率可能是由于聯(lián)合體的協(xié)同作用[23]。

3 結(jié)論

本研究以PAHs為主要碳源進(jìn)行定向厭氧富集，發(fā)現(xiàn)深海沉積物富集群落中主要類群為鹽單胞菌，從中分離獲得的菌株HalomonastitanicaePA16-9能夠高效厭氧降解苯并(a)芘和芘。此前報(bào)道該類群降解烴類物質(zhì)均發(fā)生在好氧條件下，這是首次對(duì)鹽單胞菌展開厭氧烴代謝研究和報(bào)道。這種鹽單胞菌不僅在厭氧烴降解菌群中占有主要豐度，并且具有廣泛的生態(tài)位，在鹽度、氧氣限制等生物修復(fù)工程中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。