王戰(zhàn)輝，張素霞，吳聰明，沈建忠

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

藥物化學(xué)指的是應(yīng)用化學(xué)和生物學(xué)的概念及方法發(fā)現(xiàn)、確證和開發(fā)新藥，從分子水平上研究藥物的作用機制及其在體內(nèi)的作用方式。藥物化學(xué)的內(nèi)容涉及發(fā)現(xiàn)、修飾和優(yōu)化先導(dǎo)化合物，從分子水平上揭示藥物及具有生理活性物質(zhì)的作用機理，研究藥物及生理活性物質(zhì)在體內(nèi)的代謝過程。近代藥物化學(xué)的發(fā)展非常迅速。藥物化學(xué)家們一直在研究如何能夠通過合理藥物設(shè)計而發(fā)現(xiàn)新藥，在計算機科學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科高速發(fā)展的今天，特別是計算機輔助藥物分子設(shè)計(computer aided drug design，CADD)的完善，利用計算機模擬、高效合成技術(shù)可以加快新藥發(fā)現(xiàn)的速度，降低新藥開發(fā)的成本[1]。CADD已經(jīng)成為當(dāng)前藥物合理設(shè)計中不可或缺的環(huán)節(jié)。

據(jù)統(tǒng)計，藥物作用的靶點中最多的是受體，其次是酶，另外還有離子通道和核酸，但占比較少。盡管藥物作用靶點可能不同，但是藥物的作用方式都是以非鍵相互作用為主，比如疏水作用力、氫鍵、范德華力等[2]。相對于比較直觀的原子與原子之間的共價鍵、離子鍵等，非鍵相互作用要更加抽象。目前，主流的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析方法有X射線晶體衍射法、核磁共振法和冷凍電鏡法3種。X射線晶體衍射法的前提是獲得蛋白質(zhì)晶體，然后通過X射線衍射解析蛋白的三級結(jié)構(gòu)，這種方法分辨率較高，一般能做到0.3 nm以內(nèi)。核磁共振法要求蛋白分子量要小且穩(wěn)定，適用范圍要小于X射線衍射法。近些年發(fā)展比較迅速的冷凍電鏡法有其得天獨厚的優(yōu)勢，適合用于解析病毒、細胞等生物結(jié)構(gòu)中較大的蛋白質(zhì)，但也有分辨率不高，不適合解析較小蛋白質(zhì)的缺點。目前，通過冷凍電鏡解析的最小蛋白質(zhì)為52 ku，分辨率僅有0.32 nm[3]。總體而言，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)解析的速度較慢，成本較高，很多時候不能滿足科研的需要。因此，基于蛋白的一級結(jié)構(gòu)建立其三維結(jié)構(gòu)模型就成為一種非常重要的計算機模擬技術(shù)。

隨著蛋白質(zhì)建模技術(shù)的發(fā)展，建模方法逐漸歸為兩種，分別是從頭設(shè)計和同源建模。從頭設(shè)計依賴強大的計算資源和復(fù)雜的算法，應(yīng)用沒有同源建模廣泛。同源建模是在有相似蛋白質(zhì)模板的情況下構(gòu)建目標(biāo)序列的三維結(jié)構(gòu)模型的方法，而且是目前使用最廣泛、預(yù)測最可靠的建模方法[4]。通過建立蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，對于深入研究藥物與靶點之間的非鍵相互作用具有重要的意義，為藥物的合理設(shè)計提供理論基礎(chǔ)。獲得蛋白質(zhì)的模型后，就可以對其進行分子對接，分析受體-配體之間的相互作用。分子對接的產(chǎn)生可以追溯到19世紀(jì)Fisher提出的受體學(xué)說，最經(jīng)典的模型就是鎖鑰模型[5]。隨著受體學(xué)說的發(fā)展，人們對藥物分子與靶點的相互作用有了更深入的認(rèn)識。目前，基于藥物分子與靶點之間的空間匹配和能量匹配的分子對接方法主要分為剛性對接、半柔性對接和柔性對接3類[6]。剛性對接計算量相對較小，參與對接的藥物分子和受體的構(gòu)象均不發(fā)生變化，計算速度較快，但是計算精度較差，一般用于大分子對接或大量對接初步篩選等。柔性對接需要的計算量較大，該方法需要同時把藥物分子和受體構(gòu)象的變化考慮進去，因此，適合精確的分子對接。半柔性對接需要的計算量適中，一般固定受體的構(gòu)象，然后考慮藥物分子的結(jié)構(gòu)變化，該方法的計算結(jié)果相對準(zhǔn)確，需要的計算資源又不是特別巨大，是應(yīng)用最廣泛的對接方法之一。常用的分子對接軟件有Discovery Studio、Sybyl、MOE、Rosetta、Schrodinger、AutoDock等[7]。

在本文中，選擇Discovery Studio軟件中的同源建模模塊構(gòu)建磺胺類藥物受體蛋白DHPS的三維結(jié)構(gòu)模型，然后使用半柔性對接方法CDOCKER進行受體-配體的分子對接，通過二維平面圖以及三維結(jié)構(gòu)圖展示藥物分子與受體之間的相互作用方式，借助直觀的模擬展示，以提升學(xué)習(xí)藥物化學(xué)的效果。

1 研究方法和原理

1.1 Discovery Studio簡介

Discovery Studio(DS)是基于Windows/Linux系統(tǒng)的分子建模和模擬軟件，在藥物發(fā)現(xiàn)、藥物結(jié)構(gòu)功能研究等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。DS軟件界面友好，功能完善，易于學(xué)習(xí)，是計算機輔助藥物設(shè)計最常用的模擬軟件之一[8]。DS涵蓋疾病的發(fā)病機理研究、新藥發(fā)現(xiàn)和設(shè)計、計算藥物化學(xué)、生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤藥物研究等研究領(lǐng)域。功能模塊包括基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計模塊、基于片段的藥物設(shè)計模塊、基于藥效團的藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計模塊、基于小分子的藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計模塊、蛋白質(zhì)建模及模擬模塊、分子力學(xué)、分子動力學(xué)和量子力學(xué)模擬模塊等。利用DS軟件學(xué)習(xí)藥物化學(xué)，可直觀地觀察配體與受體間的結(jié)合位點，并將兩者間的非鍵相互作用以圖形的方式展示，可對分子間相互作用有感性認(rèn)識，加深對受體-藥物相互作用的理解。DS有單機版本和免費的Discovery Studio Visualizer模塊，可隨時利用個人電腦自主練習(xí)，加深學(xué)習(xí)印象，激發(fā)對抽象概念的興趣。

1.2 蛋白質(zhì)同源建模

磺胺類藥物受體蛋白二氫蝶酸合成酶(DHPS)是研究磺胺類藥物關(guān)于細菌耐藥產(chǎn)生的影響[9]和基于此受體的新型抗菌藥物的關(guān)鍵蛋白?？蒲泄ぷ髡邆儨y定了多種來源的DHPS基因序列，并通過蛋白結(jié)晶和分子模擬技術(shù)等獲得了受體的三維結(jié)構(gòu)，目前，Protein Data Bank中已經(jīng)收錄了包括6種細菌來源、1種真菌來源的DHPS晶體結(jié)構(gòu)。

DHPS的氨基酸序列可以通過文獻或者NCBI數(shù)據(jù)庫獲得。以蛋白3tyz為例，通過NCBI下載FASTA格式的氨基酸序列文件并用DS軟件打開，展開Macromolecules下的Create Homology Models模塊，點擊BLAST Search進行模板搜索，選擇氨基酸序列一致性75%的lajoA作為模板蛋白，通常認(rèn)為一致性大于60%則模板蛋白質(zhì)量較好。點擊Load Structure and Aligment進行模板蛋白的下載和序列比對(如圖1所示)。點擊Create Homology Models模塊下的Build Homology Models，以lajoA作為模板蛋白構(gòu)建蛋白三維模型(如圖2所示)并采用拉氏構(gòu)象圖和Profile-3D對其進行評估。拉氏構(gòu)象圖通過選取主菜單Chart下的Ramachandran Plot顯示，Profile-3D通過點擊Create Homology Models模塊下的Verify Protein(Profile-3D)進行計算。

圖1 模板1ajoA與3tyz的序列比對結(jié)果

1.3 受體-配體分子對接

多種來源的DHPS已經(jīng)被解析出了晶體結(jié)構(gòu)[10]，研究發(fā)現(xiàn)，其結(jié)合位點相對固定，極大方便了對接活性位點的選擇。如果結(jié)合位點不能確定，則需要進行氨基酸突變來試驗確認(rèn)。

1.3.1 配體分子的構(gòu)建 以磺胺甲噁唑SMZ作為分子對接的配體分子。使用ChemDraw軟件繪制SMZ結(jié)構(gòu)并導(dǎo)入到DS軟件中，展開Small Molecules下的Minimize Ligands模塊，點擊Full Minimization進行小分子結(jié)構(gòu)批量優(yōu)化。配體分子的獲得途徑有很多種，對于常見的配體分子可以直接從公開的Pubchem數(shù)據(jù)庫中獲得其結(jié)構(gòu)，對于不常見的配體分子則可以通過ChemOffice或DS軟件直接繪制，再通過DS進行簡單優(yōu)化即可，當(dāng)然也可以通過高斯軟件對其進行量子力學(xué)優(yōu)化[11]，獲得其最低能量構(gòu)象。

圖2 蛋白3tyz模型(a)、拉氏構(gòu)象圖(b)及其Profile-3D圖(c)

1.3.2 定義結(jié)合位點以及分子對接 要進行分子對接，首先要定義結(jié)合位點。展開DS軟件中Receptor-Ligand Interactions下的Define and Edit Binding Site模塊，點擊From Receptor Cavities，可獲得多個活性位點，由于磺胺類藥物受體蛋白DHPS的活性口袋相對固定，選擇與以往研究和實驗相符的口袋作為分子對接結(jié)合位點。確定結(jié)合位點之后進行分子對接，展開Receptor-Ligand Interactions下的Dock Ligands模塊，點擊Dock Ligands(CDOCKER)，選好受體、配體和活性位點點擊確定進行對接計算。對接完成后，展開Receptor-Ligand Interactions下的View Interactions，點擊Ligand Interactions，即可展示受體-配體相互作用關(guān)系。點擊Show 2D Diagram，就可以看到平面的受體-配體互作圖(如圖4所示)，點擊Hydrophobic，可以展示受體疏水作用表面(如圖5a所示)；點擊H-bond，可以展示受體氫鍵表面(如圖5b所示)。

圖3 3tyz蛋白模型與配體分子的對接構(gòu)象圖(a)和3tyz蛋白晶體復(fù)合物圖(b)

圖4 受體-配體相互作用平面圖

圖5 受體疏水作用力表面圖(a)和氫鍵作用力表面圖(b)

2 結(jié)果

2.1 DHPS序列比對、同源建模與評估

3tyz氨基酸序列與模板蛋白lajoA的氨基酸序列進行比對(如圖1所示)，一致性較好，達到75%，深藍色表示氨基酸完全一致，代表一致性，淺藍色表示氨基酸不一樣但性質(zhì)相近，代表相似性，序列比對結(jié)果比較理想，滿足一致性大于60%的條件，因此選擇lajoA為模板蛋白。以lajoA為模板進行同源建模后，可以看到建模后的3tyz三維結(jié)構(gòu)(如圖2a所示)。拉氏構(gòu)象圖中藍線內(nèi)為“最適區(qū)”，該區(qū)域的氨基酸數(shù)量越多，結(jié)構(gòu)越可信，紫色線內(nèi)為“允許區(qū)”，表示結(jié)構(gòu)可接受，紅色點表示構(gòu)象不合理的氨基酸需要優(yōu)化。評估結(jié)果顯示，氨基酸處于合理區(qū)間的比例大于95%，符合要求。圖2c為Profile-3D評估法中每個氨基酸的打分情況，氨基酸打分低于0的只有2個，大部分氨基酸打分較高，說明模型質(zhì)量較好。通過評估，建立的3tyz模型符合要求。3tyz蛋白模型對接后與3tyz蛋白復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)進行對比，模型與結(jié)晶結(jié)構(gòu)相似性非常高(圖3a，3b)。以存在晶體結(jié)構(gòu)的3tyz進行同源建模的目的是為了模型能夠與晶體結(jié)構(gòu)進行比較，沒有實際的應(yīng)用意義，通常有了晶體結(jié)構(gòu)就不需要再進行蛋白建模。建模模型與晶體結(jié)構(gòu)相比較可以更加直觀的展示同源建模技術(shù)。

2.2 受體-配體分子對接及相互作用關(guān)系

蛋白模型與配體SMZ能夠很好地進行對接，對接結(jié)果顯示，氨基酸THR(73)、ARG(74)和ARG(266)與SMZ發(fā)生氫鍵相互作用，用綠色表示；氨基酸LYS(232)與SMZ發(fā)生弱氫鍵相互作用，用淺綠色表示；氨基酸PHE(201)、PRO(75)、ARG(74)、LYS(232)與配體存在范德華力，較強的力用紫色表示，較弱的力用淺紫色表示(圖4所示)。最優(yōu)分子對接結(jié)果表明，受體3tyz與配體SMZ主要通過疏水作用力(圖5a)、氫鍵(圖5b)等作用力結(jié)合在一起。受體-配體間的范德華力一般較弱，起次要作用。這與通常認(rèn)為的受體-配體相互作用規(guī)律一致，一般情況下，疏水作用力的影響最大，氫鍵次之[12]。

3 展望

在學(xué)習(xí)藥物化學(xué)時正確、有效地使用DS軟件，開展同源建模和分子對接研究，可讓原本難以理解的受體-藥物分子互作的微觀過程以圖形或動態(tài)方式呈現(xiàn)，使枯燥乏味的學(xué)習(xí)活動變得生動形象、易于接受，可大幅提高學(xué)習(xí)效率，為我國獸藥研發(fā)領(lǐng)域培養(yǎng)合格的藥學(xué)人才提供可靠而有力的技術(shù)支撐。