王 雷，劉 猛，榮 恒，柳 楠，賀建寧*

（1.青島農業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.臨沂市蘭山區(qū)畜牧發(fā)展促進中心，山東臨沂 276600）

羊毛是毛用羊的主要產品之一，也是毛紡工業(yè)原料的主要來源。羊毛的產量和品質決定了毛用羊的經濟價值，遺傳和環(huán)境等因素影響著羊毛的生長，而遺傳是決定羊毛產量和品質的基礎。毛發(fā)產生于毛囊，毛囊的生長發(fā)育規(guī)律和結構特征影響著羊毛的性狀，也是探究毛囊生長發(fā)育調控機制的基礎。毛囊是能夠自我再生的皮膚器官，其生長受一系列通路及基因的調控。研究表明Dickkopf 2（）基因在毛囊發(fā)育、毛發(fā)生長周期、組織器官胚胎發(fā)育、腫瘤等病變中有重要調控作用。

DKK 基因家族包含了，它們編碼了由255～350 個氨基酸組成的分泌性糖蛋白，能與Wnt 配體競爭性結合受體LRP5/6 從而抑制與毛囊生長發(fā)育相關的經典Wnt/-catenin 信號通路。Wnt/-catenin 信號通路對毛囊的生長起重要作用，它可以調控毛囊形態(tài)發(fā)生和毛囊再生，對毛囊干細胞的增殖和分化有調控作用。有研究指出，Wnt/-catenin 通路可治療脫發(fā)疾病，其機制源于Wnt/-catenin 刺激休眠期的毛囊從而致使毛發(fā)的再生。目前，有關在毛囊發(fā)育中表達生長周期的調控作用已初步探究，但有關和Wnt/-catenin 信號通路在調控毛囊發(fā)育和生長周期的相互作用關系和分子機制還研究較少。本研究將通過過表達基因，探討對毛囊生長發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 采集40 日齡敖漢細毛羊胎羊皮膚組織，實驗羊來自青島奧特種羊場。

1.2 試劑及儀器 Roche TRIZol 試劑、Roche 反轉錄試劑盒、TaKaRa 膠回收純化試劑盒、TIANGEN pGM-T克隆載體、Omega 質粒抽提試劑盒、pcDNA3.1 質粒載體、l、l 限制性核酸內切酶，HyClone DMEM高糖培養(yǎng)基、gibco 胎牛血清、HyClone DPBS（磷酸緩沖液），以上試劑均購自青島尚賽科貿有限公司。

1.3 質粒構建

1.3.1 引物設計 從綿羊組織中提取總RNA，并反轉錄為cDNA，參考Genbank 數據庫中綿羊基因序列（登錄號為ΧM_004009640.4），設計引物并進行CDS區(qū)全長的擴增。在上下游引物5' 端分別加入l、l 限制性內切酶的酶切位點及保護位點?；虻囊镌O計結果為：上游引物：5'-CTAGCTAGC TCCTCCTTCCCATTTGTATCCGTAT-3'；下游引物：5'-CGGGTACC CTTGTCCTCAGAGGTGGTCATATTT-3'。

PCR 體系為25 μL：cDNA 模板為1 μL（80 ng/μL），上下游引物各1 μL（10 μmol/L），Green Mix 22 μL。將PCR 產物進行1%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 TA 克隆 首先將PCR 產物純化回收，并將回收后的產物與T 載體連接。pGM-T 載體連接體系：10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL；T4 DNA Ligase（3 U/μL）2 μL：pGM-T 載體（50 ng/μL）DNA 片段5 μL；反應條件設置為25℃金屬浴反應2 h，4℃過夜連接。

1.3.3基因與pcDNA3.1 載體連接 對TA 克隆載體及pcDNA3.1 質粒同時進行雙酶切，酶切體系為：l 1 μL、l 1 μL、Buffer 1 μL、pGM-DKK2 10 μL、pcDNA3.1 10 μL、ddHO 28 μL，37℃水浴2 h，分別對基因和pcDNA3.1 載體雙酶切產物進行膠回收純化后連接。連接體系為：基因5 μL、pcDNA3.1 4 μL、T4 DNA 連接酶1 μL，T4 DNA 連接酶Buffer 1 μL；反應條件設置為：22℃金屬浴反應2 h，16℃金屬浴反應3 h，反應完成后立即轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5，劃線法接種于含氨芐青霉素的固體LB 培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，第2 天挑取單菌落并接種于液體LB 培養(yǎng)，150 r/min、37℃搖菌12 h，進行菌液PCR 鑒定，并將陽性組送至生工生物工程股份有限公司進行一代測序進一步鑒定，通過質粒提取試劑盒提取陽性質粒。

1.4 成纖維細胞的分離及培養(yǎng) 取40 日齡胎羊，徹底消毒后去除胎羊的頭部和四肢，將軀干剪成1.5 mm 和2 mm 大小的組織塊均勻分散放入培養(yǎng)皿中，胎牛血清（FBS）37℃預熱5 min 加入培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% 的CO培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h 后，加入完全培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+1% 雙抗）繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后再次更換完全培養(yǎng)基，定期在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況。當原代細胞生長密度達到95% 時進行細胞傳代培養(yǎng)，傳代時吸出原培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化4 min，待細胞變圓，加入3倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，轉移細胞至15 mL 離心管中，1 000 r/min 低速離心5 min，吹打混勻培養(yǎng)皿內的液體使之形成細胞懸液，按照1:3 的比例將重懸液平均分配到3 個培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)直至細胞匯合度達到90% 時，進行第2 次傳代培養(yǎng)。

1.5 細胞瞬時轉染 待匯合度達到90%進行轉染。轉染試劑為Lipofectamine 2000，其分別加入20 μL 的脂質體試劑和不含有雙抗的480 μL 的DMEM，混勻后靜置10 min，在實驗組中加入40 μL 的重組質粒和460 μL 的DMEM（不含雙抗），對照組加入500 μL 的DMEM，靜置20 min，放入37℃培養(yǎng)箱內，6 h 后更換完全培養(yǎng)液再培養(yǎng)36 h。

1.6 轉染細胞的定量檢測 待實驗組和對照組細胞匯合度達到90%，提取細胞總RNA 并反轉錄為cDNA，用PrimerPremier 5.0 軟件針對敖漢細毛羊基因的CDS 區(qū)和綿羊基因的CDS 區(qū)進行引物設計，引物序列信息如表1 所示。

表1 引物信息基因

熒光定量PCR 反應程序為：95℃預變性7 min；95℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，設置45 個循環(huán)。參考CT 值，用2法進行相對表達量計算。實驗組和對照組分別設置3 個重復，用SPSS 17.0 軟件進行差異顯著性分析。

1.7 Western Blot 檢測DKK2 蛋白表達量 將質粒轉染后的細胞和未做質粒轉染實驗的細胞分別作為實驗組及對照組，每組設置3 個平行樣品。提取細胞總蛋白，以其為模板進行Western Blot，以-actin 作為內參蛋白。首先對提取的蛋白進行轉膜，用5% 的BSA 進行蛋白封閉2 h，TBST 洗膜3 次，每次洗5 min；將一抗按1:2 000 的比例稀釋，孵育1 h；用TBST 洗膜3 次，每次洗5 min，選擇山羊抗兔的二抗進行1:2 000 的比例稀釋，孵育1 h；用TBST 洗膜3 次，每次洗5 min，在暗室中進行曝光。

2 結果

2.1 RNA 提取 RNA 提取后，進行電泳檢測，結果如圖1 所示，得到3 條清晰的條帶，從大到小依次為28 s、18 s、5 s，說明RNA 完整性較好，可用于后續(xù)實驗。

圖1 RNA 電泳鑒定

2.2基因PCR 擴增 如圖2 所示，擴增產物大小為780 bp 且條帶明亮無雜帶，與已知的目的基因大小一致。

圖2 DKK2 基因PCR 產物鑒定

2.3 TA 克隆 將T 載體與目的基因進行連接，目的基因片段為780 bp，T 載體大小為3 015 bp，目的基因連接到T 載體上大小在3 795 bp 處（圖3），與已知大小基本相吻合并且條帶單一無雜帶，結果顯示克隆載體構建成功，可用于后期的酶切實驗。

圖3 克隆載體的鑒定

2.4 TA 克隆測序比對 將克隆載體轉化至大腸桿菌DH5中，震蕩培養(yǎng)12 h，將菌液送至生工生物工程股份有限公司進行一代測序。如圖4 所示，TA 克隆的過程中堿基沒有發(fā)生突變，可進行下一步的表達載體構建。

圖4 TA 克隆測序比對

2.5 TA 克隆載體、pcDNA3.1 表達載體雙酶切 如圖5所示，PGM-T-DKK2 載體經酶切后的片段為780 bp 和3 015 bp，與已知大小吻合，可用于構建重組質粒。

圖5 克隆載體及pcDNA3.1 載體雙酶切

2.6 表達載體pcDNA3.1 構建及鑒定 將目的基因與pcDNA3.1 分別切膠回收，連接后轉化到大腸桿菌DH5中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，對菌液進行PCR 反應后經電泳鑒定，條帶在780 bp 處（圖6），說明目的基因成功連接到pcDNA3.1 載體上。

圖6 表達載體pcDNA3.1 的菌液PCR 鑒定

2.7 qRT-PCR 檢測基因表達 以成纖維細胞cDNA為模板進行PCR 擴增，電泳結果如圖7 所示，與預期片段大小一致，引物可用于熒光定量PCR 的擴增。

圖7 內參基因GAPDH（A）目的基因DKK2 擴增產物(B)

熒光定量PCR 擴增曲線、熔解曲線如圖8 所示。實驗組與對照組目的基因相對表達量差異極顯著（圖9）。

圖8 DKK2 和GAPDH 溶解曲線峰值圖（A）和擴增曲線圖（B）

圖9 DKK2 基因mRNA 相對表達量

2.8 Western Blot 檢測蛋白表達量 如圖10 顯示，實驗組蛋白條帶灰度明顯高于對照組。Image J 軟件進行蛋白條帶分析，數據顯示實驗組的DKK2 蛋白表達量極顯著高于對照組（圖11）。

圖10 DKK2 蛋白表達條帶

圖11 DKK2 蛋白相對表達量

3 討 論

調節(jié)毛囊生長發(fā)育的信號分子主要分為Wnt 通路、BMP 通 路、NOTCH 通 路、TNF 家 族、FGF 家族、Shh 家族等。綜合前人研究，Wnt 信號可以對正常機體的平衡進行維持，能夠對細胞增殖、分化、凋亡等一系列生理過程產生影響，且Wnt 通路極為保守。和通過拮抗經典Wnt 信號通路在毛囊的初始發(fā)生、毛囊的密度中起負性調控作用。基因在物種間具有較高的保守性，在人、小鼠、牛、山羊和豬中CDS 序列都具有很高的相似性。Sick確定WNT 及其抑制劑DKK 是小鼠毛囊間距的主要決定因素。Song通過制備基因敲除鼠，使小鼠無毛區(qū)長出毛發(fā)。人的基因被認為是腸道干細胞的Notch 信號的靶標，在靈長類動物中創(chuàng)建或增強的Notch-DKK2 信號傳導環(huán)與WNT-DKK1 和BMP-IHHSFRP1 信號傳導環(huán)互補，可用于負調控經典WNT 信號傳導通路。基因在癌癥相關的研究較多，研究表明DKK2 能促進多種腫瘤發(fā)生。Sun研究發(fā)現miR-154 可以通過直接抑制基因以激活Wnt信號通路并增強了心臟成纖維細胞的活性。基因在經濟動物上的研究較為少見。陶虎成功構建了牛Dkk2-pcDNA3.1 表達載體，通過轉染CHO 細胞驗證了其mRNA 及蛋白表達水平均顯著上升。周佳偉等研究發(fā)現基因內的第2 內含子的一個新的SNP位點與豬的產活仔數顯著相關。高建斌通過PCRSSCP 技術研究了秦川?；騍NPs 與體尺性狀和肉質性狀之間的關聯性。封竣淇等發(fā)現黔北麻羊基因和甲基化與生長性狀的相關性。

本實驗分離了敖漢細毛羊胚胎成纖維細胞，成功構建綿羊基因的pcDNA3.1 表達載體。成纖維細胞來源于中胚層，而中胚層一般在胚胎發(fā)育第5 周末形成。本實驗選擇40 日齡胎羊，細胞狀態(tài)及活力較好，更有利于原代細胞的培養(yǎng)；且胎羊體積相對較小，便于操作。脫發(fā)目前仍是困擾人類的難題，探究調控毛發(fā)生長周期的分子機制尤為重要，細毛羊可以作為研究毛發(fā)生長分子機制的良好的動物模型。本實驗可以作為研究DKK2 在細毛羊生長發(fā)育調控機制的基礎，基因對細毛羊毛囊生長的調控還需要進一步驗證。

4 結 論

本研究構建了pcDNA3.1-DKK2 過表達載體，通過轉染敖漢細毛羊成纖維細胞，對綿羊基因進行過表達。熒光定量qPCR 結果表明，實驗組基因表達量極顯著高于對照組，Western Blot 結果顯示實驗組DKK2 蛋白表達量極顯著高于對照組，進一步證明了基因過表達實驗模型的建立。