王興亞，張守梅，郭玉秋，張娜娜，陳利容，龔魁杰，劉開(kāi)昌

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

玉米收獲時(shí)籽粒含水量較高，一般在30%以上［1］，若直接脫粒胚部種皮易碎，為霉菌提供營(yíng)養(yǎng)，入倉(cāng)后存在存貯變質(zhì)、毒素滋生、營(yíng)養(yǎng)下降等諸多問(wèn)題。為了降低籽粒含水量，玉米需要晾曬、烘干等環(huán)節(jié)，但成本較高［2］。因此，探索一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的貯藏方法是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵所在。有研究表明，玉米籽粒濕貯能夠更好地貯存，防止發(fā)霉變質(zhì)，保持營(yíng)養(yǎng)成分，減少浪費(fèi)，降低飼料成本，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益［3］。

以往針對(duì)全株玉米青貯的研究表明，收獲期會(huì)影響青貯飼料的霉菌毒素、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及發(fā)酵品質(zhì)等［4-6］。過(guò)早收獲成熟度相對(duì)較低，玉米淀粉含量低，造成產(chǎn)量以及青貯飼料能值較低［7］。同時(shí)，容易造成梭菌繁殖，影響青貯品質(zhì)［8］。收獲推后可以保證最佳的產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［9］，但是真菌數(shù)量和真菌毒素含量隨著收獲期的延后而增加［10］。而且，收獲較晚會(huì)導(dǎo)致淀粉比例較高，難以實(shí)現(xiàn)高緊實(shí)度的青貯，限制乳酸菌的生長(zhǎng)，青貯效果較差［11］。因此，適宜的收獲期是發(fā)酵的關(guān)鍵。

目前關(guān)于收獲期對(duì)玉米飼料發(fā)酵效果的研究主要集中在全株玉米和玉米秸稈，缺乏對(duì)玉米籽粒濕貯的研究。因此，本研究通過(guò)設(shè)置不同玉米籽粒收獲期，從霉菌毒素（嘔吐毒素）、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、發(fā)酵品質(zhì)方面探索最適玉米籽粒濕貯收獲期，以期為玉米籽粒濕貯的發(fā)展提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 濕貯玉米籽粒采集

濕貯玉米籽粒選用京農(nóng)科728（JNK728）品種籽粒。2020年6月25日播種于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地（117.22°E，36.98°N），10月15日收獲。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，即分別在籽粒含水量20%～30%、30%～40%和40%～50%時(shí)收獲玉米并破碎，繼而采用厭氧發(fā)酵袋發(fā)酵，重復(fù)3次。玉米籽粒含水量用谷物水分測(cè)定儀測(cè)定。分別在濕貯前和濕貯后10、20、30、90 d取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 真菌分離、純化和鑒定 稱(chēng)取5 g樣品于含有45 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，密封后置于智能恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-100B，天津歐諾儀器股份有限公司）中150 r/min振蕩20 min，靜置5 min后，取1 mL上清液于裝有9 mL滅菌蒸餾水的離心管中，混勻后依次稀釋成10-2、10-3、10-4濃度梯度。取100μL稀釋液涂布于含有1%青霉素（10000 U/mL，）和硫酸鏈霉素（10 mg/mL）的PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。室溫下培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行計(jì)數(shù)和編號(hào)，并純化至單一菌落，用無(wú)菌保種管4℃保存。

將分離純化的菌落接種于PDA培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)3～5 d，待菌落直徑擴(kuò)展到3～5 cm時(shí)，測(cè)量菌落大小，測(cè)定氣生菌絲狀態(tài)、菌落顏色和紋理形態(tài)以及是否產(chǎn)生可溶性色素等。在超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）上用無(wú)菌接種針挑取少量菌絲至滴有無(wú)菌水的載玻片上，于光學(xué)顯微鏡（IX51，日本OLYMPUS公司）下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

根據(jù)觀察結(jié)果，選取不同形態(tài)的菌株，采用熱裂解法［12］進(jìn)行真菌DNA組提取。采用基于18S核糖體DNA的ITS通用引物進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增［13］。

1.3.2 嘔吐毒素測(cè)定 嘔吐毒素采用酶聯(lián)免疫吸 附 法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定，按照試劑盒上的說(shuō)明書(shū)逐步加樣進(jìn)行反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀（GENIOS Plus，瑞士TECAN公司）在450 nm和630 nm雙波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品反應(yīng)，讀取各孔的吸光度值，計(jì)算百分吸光率。其公式如下：

式中，B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值，B0為空白對(duì)照吸光度值。

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/kg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品嘔吐毒素含量。

1.3.3 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值指標(biāo)測(cè)定 干物質(zhì)（DM）和粗灰分（Ash）含量測(cè)定參考《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》［14］進(jìn)行測(cè)定。粗蛋白質(zhì)（CP）含量測(cè)定采用凱氏定氮法。淀粉含量測(cè)定采用蒽酮比色法。

1.3.4 發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定 稱(chēng)取20 g樣品，加入180 mL無(wú)菌蒸餾水，用榨汁機(jī)榨汁后過(guò)濾，取濾液用于發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定。使用pH計(jì)（LE438，METTLER TOLEDO）測(cè)定pH值。取濾液8 mL于10 mL離心管中，加入25%偏磷酸1.6 mL，置于-4℃冰箱過(guò)夜，10000 r/min離心，取上清液，于0.45μm孔徑水相濾膜下過(guò)濾用于指標(biāo)測(cè)定。其中，乳酸含量采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定，氨態(tài)氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定。費(fèi)氏評(píng)分（FS）采用王國(guó)艮［8］的方法進(jìn)行，計(jì)算公式：

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平設(shè)置為0.05，采用最小顯著法（LSD法）進(jìn)行。SigmaPlot 10.0作圖。測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件進(jìn)行序列分析和校正，在Genebank中進(jìn)行在線比對(duì)，獲得較高同源性的核苷酸序列，再初步確定其發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯真菌數(shù)量的影響

玉米籽粒濕貯前，分離出的霉菌種類(lèi)主要為鐮刀菌屬Fusarium、曲霉屬Aspergillus、青霉屬Penicillium。隨著收獲期的推遲，霉菌數(shù)量增加。玉米籽粒濕貯能明顯降低霉菌數(shù)量。發(fā)酵30 d，除20%～30%籽粒含水量下霉菌數(shù)量降低94.8%外，其余處理霉菌數(shù)量均降低100%，即降至零。發(fā)酵過(guò)程中，分離出的酵母菌以畢赤酵母Pichia kudriavzevii為主，酵母菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)，20%～30%籽粒含水量下酵母菌較活躍（表1）。

表1 不同收獲期玉米籽粒濕貯真菌數(shù)量變化

2.2 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯嘔吐毒素含量的影響

由圖1可知，收獲期對(duì)玉米籽粒嘔吐毒素含量有顯著影響。濕貯前，20%～30%含水量下籽粒嘔吐毒素含量為325.4μg/kg，顯著高于其它兩個(gè)處理。其它處理籽粒嘔吐毒素含量均較低，在1.5～31.5μg/kg之間。玉米籽粒濕貯能顯著降低嘔吐毒素含量。發(fā)酵10 d，20%～30%含水量下籽粒嘔吐毒素含量降低91%，降至30.5μg/kg。發(fā)酵90 d，各處理籽粒嘔吐毒素含量在1.7～32.3 μg/kg之間，均低于中國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中植物性飼料原料的最高限量5 mg/kg（GB 13078—2017）。

圖1 不同收獲期玉米籽粒濕貯嘔吐毒素含量變化（干基）

2.3 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表2可以看出，不同收獲期玉米籽粒的干物質(zhì)、粗灰分、蛋白質(zhì)和淀粉含量均存在明顯差異。隨著收獲期推遲，籽粒干物質(zhì)、蛋白質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），粗灰分含量降低；20%～30%含水量下籽粒淀粉含量顯著高于其它兩個(gè)處理。

表2 不同收獲期玉米籽粒濕貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變化（干基） （%）

隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，相同含水量下籽粒干物質(zhì)無(wú)明顯變化；30%～40%和40%～50%含水量下粗灰分含量降低，20%～30%含水量下粗灰分含量增加；發(fā)酵30 d，蛋白質(zhì)含量明顯增加；淀粉含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。

2.4 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3看出，濕貯前，20%～30%含水量下pH值顯著低于其它兩個(gè)處理，40%～50%含水量下NH3-N含量顯著低于其它兩處理（P＜0.05）。

表3 不同收獲期玉米籽粒青貯發(fā)酵品質(zhì)變化（干基）

隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各處理玉米籽粒pH值整體呈降低趨勢(shì)，高水分含量下pH值降速較快。發(fā)酵30 d，除20%～30%含水量外，其它兩處理pH值均降至4.3以下；發(fā)酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍為4.71。發(fā)酵90d，30%～40%和40%～50%含水量下乳酸和NH3-N含量顯著高于20%～30%含水量（P＜0.05）。發(fā)酵30 d和90 d，30%～40%含水量下費(fèi)氏評(píng)分最高。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯真菌及嘔吐毒素的影響

本研究中，隨著收獲期推遲，霉菌數(shù)量以及嘔吐毒素含量均增加。主要是因?yàn)樽魑锷笃?，隨著收獲期推遲，真菌感染、生長(zhǎng)以及毒素積累的風(fēng)險(xiǎn) 將 會(huì) 增 加［10，15］。本 研 究 中，發(fā) 酵30 d，20%～30%含水量下霉菌數(shù)量降低94.8%，其它兩處理均降低100%，即降至零，這可能是乳酸菌在發(fā)揮作用。因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中起主導(dǎo)作用的是乳酸菌，乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生乳酸使?jié)褓A玉米籽粒變?yōu)樗嵝?，逐漸形成不利于腐敗菌生長(zhǎng)的條件［16］。但是，收獲期會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中的乳酸菌生長(zhǎng)，含水量較低時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)受到抑制，而此時(shí)酵母菌與乳酸菌爭(zhēng)奪糖分，快速繁殖［17］。因此，20%～30%含水量下酵母菌含量較高。本研究中，發(fā)酵10 d，20%～30%含水量下嘔吐毒素含量降低91%。有研究表明，乳酸菌和酵母菌均可以結(jié)合或降解發(fā)酵飼料中的霉菌毒素，使?jié)褓A過(guò)程中真菌毒素含量下降［18］。但是，嘔吐毒素下降的具體原因以及機(jī)理還需要進(jìn)一步探索。

3.2 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

隨著收獲期的改變，玉米籽粒的營(yíng)養(yǎng)成分也發(fā)生差異性變化［19］。本研究中，隨著收獲期推遲，玉米籽粒濕貯前后均表現(xiàn)為干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和淀粉三者含量增加。這和以往研究結(jié)果一致［20］。因?yàn)樽蚜Ｐ纬善谌~片光合產(chǎn)物和莖葉中貯存的干物質(zhì)集中向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)，籽粒干物質(zhì)量逐漸增加，其淀粉和蛋白質(zhì)含量也均在蠟熟后期至成熟階段呈現(xiàn)最大值。

3.3 不同收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

研究表明，收獲期對(duì)玉米籽粒濕貯具有顯著影響，過(guò)低的籽粒含水量不利于發(fā)酵［21］。本研究中，發(fā)酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍為4.71，未達(dá)到發(fā)酵要求標(biāo)準(zhǔn)，并且其乳酸和NH3-N含量顯著低于高含水量處理。主要是因?yàn)檫m宜的水分是乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵的必要條件，較高水分含量乳酸菌比較活躍，而水分含量低會(huì)使物料難以壓實(shí)，乳酸菌發(fā)酵緩慢，產(chǎn)酸較少，pH值也降低的相對(duì)緩慢［19］。微生物的蛋白質(zhì)水解過(guò)程會(huì)影響發(fā)酵玉米的NH3-N含量，高水分玉米由于發(fā)酵比較活躍，因此NH3-N含量高，這與Schmidt等（2009）［22］的研究結(jié)果一致。費(fèi)氏評(píng)分主要由干物質(zhì)含量和pH值計(jì)算得到，是評(píng)估發(fā)酵效果的標(biāo)準(zhǔn)之一［5］。本研究中，30%～40%含水量下費(fèi)氏評(píng)分最高，與20%～30%含水量相比，其pH值降速較快，pH值較低，同時(shí)干物質(zhì)含量高于40%～50%含水量處理。

綜上所述，濕貯玉米籽粒最佳收獲期為含水量30%～40%。