王燕燕 趙夢(mèng)醒 劉廷志

（天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457）

淡水水域藻類(lèi)大量繁殖導(dǎo)致河流湖水等顏色變化的現(xiàn)象被稱(chēng)為“水華”，海水的這種現(xiàn)象被稱(chēng)為“赤潮”［1］。水體富營(yíng)養(yǎng)化可引起浮游植物迅速增殖，使水中溶解氧量下降，水生生物大量死亡。目前，控制“水華”的方式雖然有很多，如物理法、化學(xué)法和生物法等，但將其大規(guī)模應(yīng)用時(shí)均存在操作難度較大、成本較高、破壞水體生態(tài)系統(tǒng)且不能從根本上解決水體富營(yíng)養(yǎng)化的問(wèn)題。化感作用和化感抑藻的研究為“水華”藻的治理提供了一個(gè)新思路，已逐漸被人們廣泛認(rèn)識(shí)和接受［2］。近年來(lái)，化感作用被廣泛應(yīng)用于藻類(lèi)控制研究中，并取得較好的效果，但化感物質(zhì)來(lái)源和提取過(guò)程中產(chǎn)生的大量剩余物問(wèn)題越來(lái)越被廣泛關(guān)注。低成本、高效、安全、環(huán)境友好的化感物質(zhì)來(lái)源成為人們研究的重點(diǎn)［3］。

化感物質(zhì)的種類(lèi)很多，可將其分成五大類(lèi)：芳香族、脂肪族、類(lèi)萜、含氧雜環(huán)和含氮化合物，這些物質(zhì)大都對(duì)藻類(lèi)具有化感作用［4］。不同種類(lèi)和來(lái)源的化感物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)的抑制作用不同，多數(shù)研究者認(rèn)為，化感物質(zhì)主要使葉綠素A含量減少，影響細(xì)胞的光合產(chǎn)物，并通過(guò)改變抗氧化酶活性，損害細(xì)胞膜內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，使藻細(xì)胞受到破壞，最終影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)。此外，有些化感物質(zhì)還會(huì)損壞藻類(lèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞解體［5］。來(lái)源于陸生大型植物的化感物質(zhì)因其抑藻效果顯著、來(lái)源廣泛、生物安全性好等特點(diǎn)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。塔爾油作為一種松木硫酸鹽法制漿過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量大且來(lái)源穩(wěn)定。塔爾油中含有脂肪酸、萜類(lèi)及甾類(lèi)等化學(xué)物質(zhì)［6-7］，這些物質(zhì)與植物的化感物質(zhì)具有相似性，因此通過(guò)研究塔爾油對(duì)藻類(lèi)的抑藻控藻效果，不僅能夠開(kāi)辟一種全新的陸生植物化感物質(zhì)來(lái)源，還可提高制漿造紙副產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，符合生物質(zhì)精煉的概念，具有深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)及環(huán)境效益。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白核小球藻（FACHB-29）：采用SE培養(yǎng)基培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為（4000±100）lx，溫度為（25±1）℃，光暗比為12 h∶12 h恒溫光照培育，每天定時(shí)搖瓶2～3次，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將其接種后用于抑藻研究。塔爾油購(gòu)自美國(guó)勞特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白核小球藻的抑藻效果研究

將蛋白核小球藻用SE培養(yǎng)液培育到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，作為藻種應(yīng)用，接種10%。將塔爾油用二甲基亞砜（DMSO）溶解并適當(dāng)稀釋?zhuān)瑢⒉煌瑵舛忍荻鹊乃栍腿芤禾砑拥浇臃N好的蛋白核小球藻的培養(yǎng)基中，每個(gè)樣品中加入的塔爾油體積相同，為300μL（150 mL培養(yǎng)液），并控制塔爾油濃度分別為100和150 mg/L，對(duì)照組中只加入300μL DMSO，然后進(jìn)行培養(yǎng)并定期取樣檢測(cè)。

采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定藻細(xì)胞密度，通過(guò)與對(duì)照組對(duì)比計(jì)算抑藻率。藻液吸光度和除藻后吸光度分別通過(guò)測(cè)定508、285 nm處吸光度進(jìn)行計(jì)算，采用0.45 μm的膜過(guò)濾去除藻細(xì)胞。

1.2.2 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻的抑藻機(jī)理研究

葉綠素A含量的測(cè)定：超聲波輔助熱乙醇提取葉綠素A并進(jìn)行測(cè)定［8］。

藻蛋白、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。

藻液Zeta電位和粒徑采用Zeta電位儀（FPA，德國(guó)AFG）、激光粒度儀（LS13 320，美國(guó)Beckman Coulter）進(jìn)行測(cè)定。

采用SYBR greenⅠ（SYBR）和碘化丙啶（PI）雙染色上流式細(xì)胞儀（CyFlow Cube6，德國(guó)Partec）檢測(cè)藻細(xì)胞的存活率［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻抑制效果研究

2.1.1 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻藻細(xì)胞密度的影響

在接種好的蛋白核小球藻液中加入濃度分別為100及150 mg/L的塔爾油（實(shí)驗(yàn)組），以研究塔爾油對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)藻細(xì)胞）生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 塔爾油對(duì)藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effect of tall oil on algae cell density

從圖1可以看出，對(duì)照組藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，呈現(xiàn)為正常的S型曲線(xiàn)。而2個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)與對(duì)照組完全不同，100、150 mg/L實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度在培養(yǎng)前期基本沒(méi)有較大變化，藻細(xì)胞增殖不顯著，第5天之后，實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度呈緩慢上升趨勢(shì)，但始終比對(duì)照組的藻細(xì)胞密度低很多。實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度遠(yuǎn)低于對(duì)照組，說(shuō)明塔爾油對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)確實(shí)起到了抑制作用。在第5～6天，對(duì)照組藻細(xì)胞密度出現(xiàn)平臺(tái)期，而后開(kāi)始快速增大，按照正常生長(zhǎng)規(guī)律，第6天后的藻細(xì)胞密度快速增大應(yīng)該與進(jìn)入衰退期藻細(xì)胞的死亡和碎解有關(guān)，分解產(chǎn)生的碎片干擾了血球計(jì)數(shù)。李麗娟［11］在研究楊木APMP制漿廢水中化感物質(zhì)對(duì)蛋白核小球藻的抑制作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，添加化感物質(zhì)對(duì)前期藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用非常明顯，然而后期也出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。Nakai等［12］在研究植物浸提液對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在浸提液投加8天后其抑藻作用減弱，這與本研究得到的結(jié)果類(lèi)似，推測(cè)應(yīng)該是與藻細(xì)胞密度計(jì)數(shù)手段有關(guān)。

從圖1還可以看出，在藻細(xì)胞培養(yǎng)前2天，塔爾油有一定抑藻作用，但并不是很明顯，這是因?yàn)檎Ｔ寮?xì)胞生長(zhǎng)在接種后也有一個(gè)平臺(tái)緩沖期，接入的藻種需要一段時(shí)間適應(yīng)，繁殖相對(duì)較慢，因此加入和不加入抑藻物質(zhì)差異并不顯著。到第3天后，藻細(xì)胞進(jìn)入快速增殖階段，塔爾油對(duì)藻細(xì)胞的抑制作用開(kāi)始表現(xiàn)出來(lái)，抑藻率達(dá)到80%左右，后期隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，塔爾油對(duì)藻細(xì)胞的抑制作用始終維持在較高的水平，塔爾油濃度為100 mg/L時(shí)的抑藻率最高達(dá)到88%。吳湘等［13］在研究黃花水龍化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的作用效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加75～150 mg/L化感物質(zhì)時(shí)，其抑藻率達(dá)80%以上，即認(rèn)為黃花水龍化感物質(zhì)具有較好的抑藻效果，本研究的化感物質(zhì)濃度及抑藻效果與前人研究結(jié)果基本相當(dāng)。

2.1.2 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻液吸光度的影響

藻液吸光度是藻類(lèi)生長(zhǎng)的一個(gè)主要參數(shù)指標(biāo)，藻液吸光度主要與藻細(xì)胞密度有關(guān)，可用以確定藻類(lèi)生長(zhǎng)速度。在培養(yǎng)后期，藻液吸光度除與藻細(xì)胞密度有關(guān)外，還與培養(yǎng)液中溶解的葉綠素等色素含量相關(guān)。除藻細(xì)胞外，藻液吸光度主要由溶解性色度物質(zhì)貢獻(xiàn)，與藻細(xì)胞生長(zhǎng)健康狀態(tài)直接相關(guān)，健康細(xì)胞很少向培養(yǎng)液中釋放有色物質(zhì)。圖2所示為塔爾油對(duì)蛋白核小球藻液（以下簡(jiǎn)稱(chēng)藻液）過(guò)膜除藻前后吸光度的影響。

從圖2（a）可以看出，除第4天略有波動(dòng)外，對(duì)照組的藻液吸光度整體呈持續(xù)升高趨勢(shì)，這是由于健康細(xì)胞藻液吸光度與藻細(xì)胞密度相關(guān)，藻細(xì)胞密度不斷增大表現(xiàn)為藻液吸光度不斷提高，眾多研究證明藻液吸光度值與藻細(xì)胞密度值具有較好的相關(guān)性，可用以衡量藻類(lèi)的生物量［14-16］。圖2（a）中，塔爾油濃度為100和150 mg/L實(shí)驗(yàn)組藻液的吸光度值從第1天開(kāi)始即出現(xiàn)劇烈升高趨勢(shì)，隨后吸光度值提高速度逐漸放緩。僅靠藻細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，不可能使藻液吸光度急劇升高，同時(shí)對(duì)照組也顯示正常生長(zhǎng)的藻細(xì)胞不可能使藻液吸光度出現(xiàn)此種趨勢(shì)。

圖2 塔爾油對(duì)藻液吸光度的影響Fig.2 Effect of tall oil on theabsorbanceof algaeliquid

圖2（b）中，過(guò)膜除藻后對(duì)照組吸光度前期一直很低，這是因?yàn)樵谡ＩL(zhǎng)狀態(tài)下，藻細(xì)胞比較健康，很少向培養(yǎng)液中釋放有色物質(zhì)，而第6天之后，過(guò)膜除藻后藻液吸光度卻迅速升高，這主要是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，大部分藻細(xì)胞進(jìn)入衰退期，藻細(xì)胞死亡比例增加，細(xì)胞內(nèi)有色物質(zhì)被釋放出來(lái)，使得吸光度升高。而圖2（b）中，過(guò)膜除藻后實(shí)驗(yàn)組的藻液吸光度從加入塔爾油后即急劇升高，24 h內(nèi)達(dá)到最高值，然后降低，后又呈緩慢波動(dòng)升高趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樗栍偷募尤胗绊懥嗽寮?xì)胞的健康狀態(tài)，導(dǎo)致藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞或藻細(xì)胞死亡，藻細(xì)胞內(nèi)的有色物質(zhì)大量溶出，從而使藻液吸光度升高。劉光濤等［17］采用高劑量壬酸對(duì)銅綠微囊藻和混合培養(yǎng)藻類(lèi)進(jìn)行處理，隨后分別對(duì)2種藻液的光密度值進(jìn)行測(cè)定；結(jié)果顯示，其藻液光密度值在早期也出現(xiàn)了急劇升高現(xiàn)象，研究者認(rèn)為是壬酸致使藻類(lèi)死亡，其殘余物干擾了測(cè)定結(jié)果。

從塔爾油對(duì)藻細(xì)胞密度和藻液吸光度的影響可以看出，塔爾油的確具有顯著的抑藻效果。

2.2 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻的抑藻機(jī)理研究

2.2.1 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻葉綠素A含量的影響

藻細(xì)胞中的葉綠素A含量通?？梢苑从吃寮?xì)胞的生長(zhǎng)和光合作用狀態(tài)［18］。圖3顯示了加入塔爾油后蛋白核小球藻葉綠素A含量的變化趨勢(shì)。

圖3 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻葉綠素A含量的影響Fig.3 Effect of tall oil on thechlorophyll Acontent of Chlorella pyrenoidosa

由圖3可知，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組葉綠素A含量在培養(yǎng)期前2天均出現(xiàn)下降現(xiàn)象。對(duì)照組葉綠素A含量的下降可能是由于藻細(xì)胞接種后有一個(gè)適應(yīng)平臺(tái)期，適應(yīng)期內(nèi)的藻細(xì)胞繁殖相對(duì)緩慢，葉綠素A分解速度大于增長(zhǎng)速度，因此總體呈下降趨勢(shì)。從第3天開(kāi)始，對(duì)照組藻細(xì)胞度過(guò)適應(yīng)平臺(tái)期，進(jìn)入快速增殖的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，藻細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，葉綠素A含量快速上升；第5天以后，葉綠素A含量又開(kāi)始劇烈下降。這是因?yàn)樵寮?xì)胞經(jīng)過(guò)5天培養(yǎng)，進(jìn)入衰退期，藻細(xì)胞活力下降，因此葉綠素A含量下降，但總體仍遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)組。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組葉綠素A含量始終保持較低水平。有研究認(rèn)為，有些化感物質(zhì)可以破壞藻細(xì)胞的葉綠素A，影響藻細(xì)胞的光合作用和同化產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)的目的［19］。朱傳雪等［20］在研究荷花種植水對(duì)巢湖藍(lán)藻的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，荷花種植水可使藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素A含量下降，研究者認(rèn)為荷花代謝化感物質(zhì)可破壞藍(lán)藻細(xì)胞并使其喪失光合作用。Ni等［21］在研究緩釋情況下亞油酸對(duì)銅綠微囊藻的化感效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，亞油酸緩釋微球?qū)嶒?yàn)組的葉綠素A含量下降明顯，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.2.2 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻抗氧化酶的影響

圖4顯示了培養(yǎng)第3天塔爾油對(duì)蛋白核小球藻的藻蛋白含量及SOD和CAT酶活力的影響。

圖4 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻抗氧化酶的影響Fig.4 Effect of tall oil on theantioxidant enzyme of Chlorella pyrenoidosa

當(dāng)外界條件改變時(shí)，藻細(xì)胞體內(nèi)的SOD和CAT酶活力會(huì)短時(shí)間提高以消除生長(zhǎng)環(huán)境出現(xiàn)的超氧根離子，從而維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)［22］。由圖4可知，加入塔爾油后藻細(xì)胞的SOD和CAT酶活力均呈應(yīng)激性提高。與對(duì)照組相比，100和150 mg/L實(shí)驗(yàn)組CAT酶活力從0.99 U/mg分別增至5.35和3.60 U/mg，為對(duì)照組的5.4和3.6倍。同樣，藻細(xì)胞SOD酶活力受塔爾油的影響出現(xiàn)激增，從對(duì)照組的1.21 U/mg分別增至2.50和4.01 U/mg，為對(duì)照組的2.1和3.3倍。這可能與蛋白核小球藻受塔爾油“脅迫”時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。Li等［23］在三葉草水提物對(duì)銅綠微囊藻的化感作用研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)剛加入三葉草水提物時(shí)，銅綠微囊藻的SOD和CAT酶活力應(yīng)激性提高，這與本實(shí)驗(yàn)中塔爾油作用于藻細(xì)胞的結(jié)果相似；Shao等［24］在研究鄰苯三酚對(duì)銅綠微囊藻的化感作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在鄰苯三酚“脅迫”下，銅綠微囊藻的SOD和CAT酶活力均出現(xiàn)了氧化應(yīng)激性提高；Hong等［25］研究發(fā)現(xiàn)，蘆木堿對(duì)銅綠微囊藻的SOD和CAT酶活力也有影響，并注意到在早期細(xì)胞暴露時(shí)，蘆木堿可以誘導(dǎo)提高CAT酶活力，但后期則會(huì)降低銅綠微囊藻的SOD酶活力。

塔爾油的加入會(huì)對(duì)蛋白核小球藻產(chǎn)生一定“脅迫”作用，蛋白核小球藻的抗氧化系統(tǒng)在短時(shí)間通過(guò)提高SOD酶活力來(lái)降低這種氧化性損傷。在受到環(huán)境“脅迫”時(shí)，細(xì)胞可能還會(huì)合成逆境蛋白用以對(duì)抗環(huán)境［26］。從圖4可以看出，實(shí)驗(yàn)組藻蛋白含量也出現(xiàn)了上升，應(yīng)該是藻細(xì)胞合成了逆境蛋白以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化所致。

2.2.3 塔爾油對(duì)藻液顆粒粒徑的影響

從藻細(xì)胞密度曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1）可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第5天測(cè)定的抑藻率最高。取抑藻率最高時(shí)的藻液，并對(duì)其進(jìn)行顆粒粒徑測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組藻液顆粒粒徑出現(xiàn)了最大粒徑和平均粒徑變大、最小粒徑變小的現(xiàn)象。對(duì)照組藻液顆粒的平均粒徑約為94.1μm，且顆粒粒徑分布在1～400μm之間，而加入塔爾油的100、150 mg/L實(shí)驗(yàn)組藻液顆粒平均粒徑分別增大到126.4和124.2μm。顆粒粒徑分布變得更加分散，最小粒徑從對(duì)照組的1μm下降到實(shí)驗(yàn)組的0.4μm，100 mg/L實(shí)驗(yàn)組顆粒在400～800μm也有分布，而150 mg/L實(shí)驗(yàn)組顆粒最大粒徑甚至達(dá)到1000μm。從圖5還可以看出，對(duì)照組顆粒粒徑在1～8和100～400μm之間有2個(gè)明顯的分布峰，加入了塔爾油的實(shí)驗(yàn)組顆粒粒徑在1～8μm之間的分布峰基本消失，100 mg/L實(shí)驗(yàn)組顆粒粒徑更均勻地分布在2～60μm之間，150 mg/L實(shí)驗(yàn)組顆粒粒徑在20～60μm之間出現(xiàn)了新的分布峰。綜合以上分析可知，塔爾油在一定范圍內(nèi)可使蛋白核小球藻液顆粒粒徑分布變得更加分散，表現(xiàn)為峰寬變大，粒徑范圍變大。這是由于塔爾油一方面可使蛋白核小球藻細(xì)胞分解破碎，從而使藻液顆粒粒徑變小，另一方面可使藻細(xì)胞更加趨向于絮聚，使得藻液顆粒粒徑增大。楊茹君［27］在研究重金屬對(duì)海洋浮游植物生長(zhǎng)過(guò)程中的粒度效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加Pb（Ⅱ）可改變赤潮異彎藻的粒徑，出現(xiàn)最大粒徑增大、最小粒徑減小的現(xiàn)象，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖5 塔爾油對(duì)藻液顆粒粒徑影響Fig.5 Effect of tall oil on the particle size of algae liquid

2.2.4 塔爾油對(duì)藻液Zeta電位的影響

Zeta電位是表征分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，已有許多研究表明，藻液的Zeta電位對(duì)藻細(xì)胞的聚集或分散有影響［28-29］。

圖6為加入塔爾油后培養(yǎng)期不同階段蛋白核小球藻液Zeta電位的變化情況。從圖6可以看出，蛋白核小球藻液Zeta電位均為負(fù)值且在-13～-36 mV之間波動(dòng)；實(shí)驗(yàn)組藻液Zeta電位絕對(duì)值明顯低于對(duì)照組，這可能是由于加入塔爾油后，蛋白核小球藻細(xì)胞受到了破壞，從而釋放大量的胞內(nèi)有機(jī)物，藻細(xì)胞更容易粘附，從而增大其絮聚趨勢(shì)，這也解釋了在藻細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)顯微鏡下細(xì)胞成團(tuán)的現(xiàn)象。培養(yǎng)過(guò)程中也可以明顯看出，實(shí)驗(yàn)組中存在絮體在瓶底沉淀的現(xiàn)象。鄭利娟等［30］在探究堿度對(duì)混凝去除銅綠微囊藻及其分泌有機(jī)物的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著堿度的增大，藻液Zeta電位絕對(duì)值逐漸減小，體系的穩(wěn)定性逐漸減弱，有助于絮體形成，與本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相似。

圖6 塔爾油對(duì)藻液Zeta電位的影響Fig.6 Effect of tall oil on the Zetapotential of algaeliquid

2.2.5 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻殺滅效果研究

為研究塔爾油對(duì)藻細(xì)胞的殺滅作用，取培養(yǎng)第5天藻細(xì)胞（抑藻率最高），經(jīng)染色后用流式細(xì)胞儀對(duì)其生存狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示。

依據(jù)死亡、活細(xì)胞所處的區(qū)域，設(shè)定合適的“門(mén)”，將其劃分為活性區(qū)與非活性區(qū)。對(duì)比圖7中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的死亡、活細(xì)胞比例可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中活細(xì)胞比例達(dá)47.2%，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，死亡細(xì)胞僅占9.7%；而加入塔爾油后，藻細(xì)胞死亡細(xì)胞比例增加，且塔爾油濃度越高，死亡細(xì)胞比例越大，100 mg/L實(shí)驗(yàn)組死亡細(xì)胞比例達(dá)62.8%，150 mg/L實(shí)驗(yàn)組死亡細(xì)胞比例增至75.7%，說(shuō)明高濃度的塔爾油不僅造成藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，還可以導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。

圖7 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞死亡率影響Fig.7 Effect of tall oil on the mortality of Chlorella pyrenoidosa cell

2.2.6 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

圖8為培養(yǎng)第5天蛋白核小球藻細(xì)胞的SEM圖。圖8（a）和圖8（b）為正常培養(yǎng)狀態(tài)下蛋白核小球藻的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，在正常生長(zhǎng)條件下，藻細(xì)胞圓潤(rùn)、飽滿(mǎn)，細(xì)胞個(gè)體分明且表面光滑，細(xì)胞分裂較旺盛。與對(duì)照組相比，加入塔爾油的實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯的變化。由圖8（c）和圖8（d）可知，加入塔爾油的實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞表面開(kāi)始凹陷，隨著塔爾油濃度的增大，藻細(xì)胞完全失去其完整性，細(xì)胞破裂，并且細(xì)胞個(gè)體不分明，常見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞粘合在一起（見(jiàn)圖8（e）和圖8（f））。這可能是由于塔爾油破壞了藻細(xì)胞的抗氧化酶，使藻細(xì)胞內(nèi)的氧自由基積累過(guò)多，過(guò)高的自由基含量導(dǎo)致藻細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化，最終出現(xiàn)凹陷甚至破裂現(xiàn)象。段書(shū)惠［5］在研究大黃有機(jī)提取物對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)，大黃提取物能夠致使藍(lán)藻細(xì)胞表面出現(xiàn)空洞凹陷，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。陳國(guó)元等［31］在香蒲和銅綠微囊藻共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，香蒲對(duì)銅綠微囊藻的亞顯微結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重影響，并認(rèn)為因?yàn)楣才囵B(yǎng)時(shí)水生植物對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生氧化“脅迫”，增加了藻細(xì)胞內(nèi)活性氧，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，藻細(xì)胞被嚴(yán)重破壞。

圖8 塔爾油對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of tall oil on the cell structure of Chlorella pyrenoidosa cell

3 結(jié)論

以塔爾油為化感物質(zhì)，研究了塔爾油對(duì)蛋白核小球藻的抑藻效果，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了初步探究。

3.1 在蛋白核小球藻接種初期加入100和150 mg/L塔爾油，均對(duì)蛋白核小球藻有明顯抑制作用，抑藻率整體維持在80%以上，最高可達(dá)88%，且塔爾油濃度（100、150 mg/L）對(duì)抑藻率影響不大。

3.2 塔爾油的加入可使蛋白核小球藻的葉綠素A含量顯著下降，而藻細(xì)胞的藻蛋白含量及抗氧化酶活力則會(huì)在塔爾油的刺激下應(yīng)激性提高；塔爾油可降低藻液Zeta電位絕對(duì)值，增加藻細(xì)胞絮聚的趨勢(shì)；粒徑分布研究結(jié)果表明，塔爾油的加入一方面使部分細(xì)胞分裂成細(xì)胞碎片，另一方面由于絮聚作用會(huì)導(dǎo)致藻液平均顆粒粒徑大幅增大。另外，塔爾油可破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)，藻細(xì)胞表面發(fā)生凹陷并最終破裂。