李 倩，何 超，龍 敏，楊繼勇，孫麗坤,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院)

抗生素是20 世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，在疾病的救治中發(fā)揮了不可替代的作用。目前，抗生素主要被用于人類醫(yī)療和動(dòng)物畜禽養(yǎng)殖。隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、集約化發(fā)展，畜禽傳染性疾病發(fā)生的可能性持續(xù)增加，抗生素使用的種類和數(shù)量也隨之增加。如四環(huán)素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、青霉素類、氟喹諾酮類等都是CLSI已公布的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)的獸用抗生素。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素常作為一種飼料添加劑添加于動(dòng)物飼料，不僅可以殺滅和抑制畜禽腸道內(nèi)的有害菌，阻止有害微生物的增殖，從而維持畜禽正常的微生態(tài)平衡，降低發(fā)病率，而且微量的抗生素能夠刺激腦下垂體，從而促進(jìn)促生長(zhǎng)激素的分泌，有效加快畜禽生長(zhǎng)發(fā)育速度。正因?yàn)楂F用抗生素具有降低動(dòng)物發(fā)病率和促進(jìn)生長(zhǎng)這樣的雙重功效，所以在養(yǎng)殖業(yè)中長(zhǎng)期以亞劑量添加于動(dòng)物飼料，并且能為畜禽養(yǎng)殖帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益，現(xiàn)已構(gòu)成抗生素在全球范圍使用的格局。

我國(guó)是世界上養(yǎng)豬第一大國(guó)，生豬存欄量、肉豬出欄量、豬肉的產(chǎn)量都位居世界第一位。但是，近年來(lái)，豬的各種疾病不斷發(fā)生，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了很大的影響。因此，在這種背景下，抗生素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。但是由于近年來(lái)養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在對(duì)抗生素長(zhǎng)期使用和濫用的現(xiàn)象，導(dǎo)致抗生素殘留、動(dòng)物腸道產(chǎn)生耐藥細(xì)菌等問(wèn)題日益凸顯。并且攝入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素大多未能被充分吸收和代謝，約有30%～90%伴隨動(dòng)物糞便排泄進(jìn)入環(huán)境中，抗生素在環(huán)境中濃度的增長(zhǎng)使得抗生素的選擇壓力加大，促進(jìn)了微生物原來(lái)所固有的抗性基因水平的提高，進(jìn)而加速了耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)。一旦有耐藥基因轉(zhuǎn)移至致病菌，那么對(duì)控制疾病的難度就會(huì)增加，這對(duì)人類的健康產(chǎn)生了巨大的威脅，所以耐藥細(xì)菌已逐漸成為危害公共健康的污染物而備受研究者們的關(guān)注。目前，已有部分關(guān)于家畜糞便細(xì)菌耐藥性的研究，但是主要是探討耐藥細(xì)菌的種類和耐藥基因的分布情況，而對(duì)于同一品種不同生長(zhǎng)階段豬糞便中耐藥細(xì)菌及多重耐藥細(xì)菌的數(shù)量的比較研究不多，缺乏系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

因此，本實(shí)驗(yàn)選取了蘭州市附近某養(yǎng)豬場(chǎng)的約克夏豬豬糞作為研究對(duì)象，采用微生物培養(yǎng)的方法，通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬糞中抗生素耐藥細(xì)菌的數(shù)量比較分析，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)豬過(guò)程中抗生素的合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選擇蘭州市附近某豬場(chǎng)(存欄量>1 000頭)中的約克夏豬豬糞作為樣品來(lái)源，采用五點(diǎn)混合取樣法，即選定豬場(chǎng)的采樣糞區(qū)后，先劃定好糞區(qū)對(duì)角線，然后將其中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，最后在兩條對(duì)角線上選擇與中心抽樣點(diǎn)距離相等的4個(gè)點(diǎn)作為采樣點(diǎn)，五點(diǎn)取樣之后將采集到的樣品充分混合。分別對(duì)該豬場(chǎng)內(nèi)的哺乳仔豬(30 d以內(nèi))、斷奶仔豬(60 d以內(nèi))、育肥豬(90 d以內(nèi))、空懷母豬進(jìn)行了取樣，并注明樣品名稱和采樣時(shí)間，將所采集的樣品各自混勻后置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其余樣品于-20 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基制備

1.2.1 LB固體培養(yǎng)基制備 在950 mL去離子水中加入胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉15～20 g。搖動(dòng)錐形瓶使溶質(zhì)全部溶解，再用5 mol·L-1的NaOH將溶液的pH調(diào)至7.0，然后用去離子水定容至1 L，最后置于高壓滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃下高壓滅菌20 min。滅菌后取出，待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃左右時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將其倒入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，厚度不宜超過(guò)2/3，且傾倒過(guò)程應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。冷卻后用封口膠封邊，倒置放于4 ℃保存?zhèn)溆?，或直接用于涂板?/p>

1.2.2 含藥液體培養(yǎng)基制備 同上述配方配置LB培養(yǎng)基并進(jìn)行高壓滅菌，待培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，分別加入對(duì)應(yīng)抗生素，充分搖勻，然后同上述操作方法進(jìn)行倒板備用。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 好氧異氧細(xì)菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 分別稱取四個(gè)不同生長(zhǎng)階段的新鮮豬糞樣品各3 g于三角瓶中，并加入30 mL無(wú)菌水和玻璃珠，搖床震蕩8 h，制備成菌懸液。采用平板菌落記數(shù)法，吸取混合均勻的菌懸液上清液進(jìn)行梯度稀釋，選擇10～3 g·mL-1、10～4 g·mL-1、10～5 g·mL-1三個(gè)梯度分別涂布在制備好的LB平板上，每一梯度均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24 h。計(jì)數(shù)LB平板上的總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)，并根據(jù)菌落數(shù)和稀釋度計(jì)算得出豬糞樣品中的細(xì)菌濃度。

同時(shí)將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P≤0.05表示差異顯著，以0.05

1.3.2 單一耐藥細(xì)菌和雙重耐藥細(xì)菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 根據(jù)1.2.2中含藥液體培養(yǎng)基的制備方法，本實(shí)驗(yàn)選擇四環(huán)素和頭孢氨芐兩種抗生素，配置成初始濃度均為50 mg·mL-1的母液，使用時(shí)分別取適量上述抗生素母液，加入到已經(jīng)滅菌的LB培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為四環(huán)素32 μg·mL-1、頭孢氨芐64 μg·mL-1，制備單一抗生素抗性平板。多重抗生素平板的制備是將上述兩種抗生素混合后加入滅菌培養(yǎng)基中，每種抗生素的終濃度均為相應(yīng)的單一抗生素平板上所使用的濃度。

將1.3中制備好的菌懸液樣品，以同樣的稀釋度涂布于單一抗生素平板和多重抗生素的平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)分別含四環(huán)素和頭孢氨芐的單一抗生素平板和雙抗平板上的耐藥細(xì)菌數(shù)，并按照以下公式計(jì)算耐藥細(xì)菌的比例。

耐藥細(xì)菌比例(%)=耐藥細(xì)菌數(shù)量÷細(xì)菌總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

養(yǎng)豬場(chǎng)的規(guī)?；l(fā)展使得其成為了抗生素的“使用大戶”，且在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素的使用大多在幼豬時(shí)期，成年豬由于生長(zhǎng)機(jī)能和疾病抵抗能力較強(qiáng)而很少使用。因此按照材料和方法所述，選擇該養(yǎng)殖場(chǎng)普遍使用的四環(huán)素、頭孢氨芐作為耐藥細(xì)菌篩選的抗生素類型。根據(jù)CLSL(抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)) ，這兩種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)分別為：頭孢氨芐≥64 μg·mL-1，四環(huán)素≥16 μg·mL-1，本實(shí)驗(yàn)選擇等于和略高于其MIC值的最終工作濃度，即頭孢氨芐64 μg·mL-1、四環(huán)素32 μg·mL-1。分別取哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和空懷母豬四個(gè)不同生長(zhǎng)階段的豬糞進(jìn)行抗性細(xì)菌培養(yǎng)，部分培養(yǎng)結(jié)果比較如圖1所示。

圖1 空白對(duì)照，四環(huán)素，頭孢細(xì)菌培養(yǎng)圖

并對(duì)4組豬糞樣品中可培養(yǎng)的菌株進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，得出總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量為8.00×107～1.07×1010cfu·g-1，單抗和2種抗生素耐藥細(xì)菌數(shù)量和總可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)或低一個(gè)數(shù)量級(jí)。其中單一耐藥細(xì)菌數(shù)量為1.00×107～8.51×109cfu·g-1，雙重耐藥細(xì)菌數(shù)量為 0～8.99×109cfu·g-1。

將統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行SPSS分析，結(jié)果如表1所示，豬的四個(gè)生理階段中，四環(huán)素組、頭孢氨芐組及四環(huán)素+頭孢氨芐組均與對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異(P<0.05)。

表1 不同生長(zhǎng)階段豬糞四環(huán)素，頭孢及雙抗耐藥細(xì)菌的數(shù)量比較

根據(jù)以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果，可進(jìn)一步比較不同生長(zhǎng)階段豬糞便中單一耐藥菌與雙重耐藥菌占總細(xì)菌的比例，其具體分析結(jié)果如下。

2.1 不同生長(zhǎng)階段豬糞中四環(huán)素耐藥細(xì)菌的分布

耐藥細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果表明，哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬以及空懷母豬糞便中四環(huán)素耐藥細(xì)菌數(shù)量分別是0.09×109cfu·g-1、7.82×109cfu·g-1、2.84×109cfu·g-1、1.99×109cfu·g-1。四個(gè)階段四環(huán)素耐藥細(xì)菌數(shù)量均和總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在同一個(gè)或低1個(gè)數(shù)量級(jí)。如圖2所示，斷奶仔豬糞便中耐四環(huán)素細(xì)菌的比例為73.02%，明顯高于育肥豬糞便(27.63%)、空懷母豬糞便(22.26%)以及哺乳仔豬糞便(0.98%)，并且哺乳仔豬糞便中耐藥細(xì)菌所占比例最低。

2.2 不同生理階段豬糞中頭孢氨芐耐藥細(xì)菌的分布

根據(jù)耐藥細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果，哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬以及空懷母豬糞便中頭孢氨芐耐藥細(xì)菌數(shù)量分別是3.42×109cfu·g-1、7.66×109cfu·g-1、8.51×109cfu·g-1、3.60×109cfu·g-1。四個(gè)階段頭孢氨別耐藥細(xì)菌數(shù)量均和總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在同一個(gè)或低1個(gè)數(shù)量級(jí)。如圖3所示，育肥豬糞便中耐頭孢氨別細(xì)菌的比例為82.78%，稍高于斷奶仔豬糞便(71.52%)，而明顯高于空懷母豬糞便(40.27%)以及哺乳仔豬糞便(37.33%)，并且哺乳仔豬糞便中耐藥細(xì)菌所占比例最低。

圖2 不同生長(zhǎng)階段豬糞中四環(huán)素耐藥細(xì)菌比例

圖3 不同生長(zhǎng)階段豬糞中頭孢氨芐耐藥細(xì)菌比例

圖4 不同生長(zhǎng)階段豬糞中雙重耐藥細(xì)菌比例

2.3 不同生理階段豬糞中雙重耐藥細(xì)菌的分布

雙抗耐藥細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明，哺乳仔豬糞便中沒(méi)有檢測(cè)到雙重耐藥細(xì)菌。耐藥細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果表明，斷奶仔豬、育肥豬以及空懷母豬糞便中雙重耐藥細(xì)菌數(shù)量分別是8.99×109cfu·g-1、1.85×109cfu·g-1、7.30×108cfu·g-1。這三個(gè)階段豬糞便中雙重耐藥細(xì)菌數(shù)量比總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，和四環(huán)素、頭孢耐藥細(xì)菌數(shù)量在同一個(gè)或低1個(gè)數(shù)量級(jí)。各生理階段雙重耐藥細(xì)菌占總可培養(yǎng)細(xì)菌的比例如圖4所示，其中斷奶仔豬糞便中雙重耐藥細(xì)菌的比例為83.94%，明顯高于育肥豬糞便(18.00%)、空懷母豬糞便(8.17%)。并與2.1和2.2的結(jié)果對(duì)比，四個(gè)生長(zhǎng)階段豬糞便中雙重耐藥細(xì)菌比例均低于單一抗生素。

3 討 論

隨著規(guī)?；?、集約化的畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展以及畜禽飼養(yǎng)密度的加大，糞便等廢棄物的產(chǎn)出量逐漸加大，抗生素的使用更加頻繁?，F(xiàn)在有許多研究已經(jīng)證明，抗生素耐藥細(xì)菌廣泛存在于畜禽糞便中。相對(duì)于養(yǎng)牛場(chǎng)、養(yǎng)羊場(chǎng)以及養(yǎng)雞場(chǎng)，在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用量更大，豬糞便中存在的耐藥細(xì)菌占比更大，也吸引了更多研究者的關(guān)注。因此本實(shí)驗(yàn)也選擇養(yǎng)豬場(chǎng)作為樣品來(lái)源，并分別采集哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬以及空懷母豬四個(gè)不同生長(zhǎng)階段的豬糞便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，耐藥細(xì)菌的分布在養(yǎng)豬場(chǎng)各生長(zhǎng)階段豬糞中存在明顯的差異，幼齡階段的仔豬糞便中耐藥細(xì)菌的比例高于成豬糞便。造成這種差異的原因可能與該養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬抗生素的使用量以及不同生長(zhǎng)階段豬對(duì)藥物的代謝能力等有關(guān)。多項(xiàng)研究表明糞便中抗生素的殘留會(huì)導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，為了明確產(chǎn)生這種差異的原因，還需要對(duì)糞便中抗生素的殘留進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)選擇四環(huán)素和頭孢氨芐兩種抗生素進(jìn)行耐藥細(xì)菌數(shù)量研究，發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)豬場(chǎng)各生長(zhǎng)階段的糞便中，耐頭孢氨芐的耐藥細(xì)菌比例幾乎都高于四環(huán)素，分別達(dá)到37.33%、71.52%、82.78%、40.27%。頭孢氨芐屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是人獸共用的廣譜類抗生素。這類抗生素比較容易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性，而且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥基因可以在人群中、動(dòng)物群中、生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌間相互傳遞。例如河北省肉牛源溶血性大腸埃希菌有23株對(duì)頭孢氨芐耐藥性高。東北地區(qū)鹿源大腸桿菌對(duì)22種抗生素具有復(fù)雜的耐藥性，其中對(duì)頭孢噻吩的耐藥性超過(guò)90%。另有報(bào)道，意大利豬肉生產(chǎn)線上的豬肉樣品中，63.60%的葡萄球菌攜帶對(duì)β-內(nèi)酰胺抗性的 blaZ 基因。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)四環(huán)素和頭孢氨芐產(chǎn)生雙重耐藥性的耐藥細(xì)菌主要分布在斷奶仔豬糞便中。原因可能是仔豬正處于從哺乳到斷奶的過(guò)渡時(shí)期，該階段是仔豬快速生長(zhǎng)期以及哺乳到斷奶過(guò)度時(shí)期,容易受外界的各種變化而產(chǎn)生應(yīng)激時(shí)期。因此需要同時(shí)使用防病和促生長(zhǎng)多種抗生素，而隨著仔豬年齡的增加，抗生素的使用量和使用種類也會(huì)隨之減少。目前，對(duì)畜禽糞便中多重耐藥細(xì)菌的研究較少，主要涉及耐藥菌株的耐藥特征研究。如唐偉欣等對(duì)畜禽糞便和有機(jī)肥中多重耐藥細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)禽畜糞便中多耐藥菌的菌門集中分布在Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，多重耐藥菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為Escherichia、Corynebacterium。檢測(cè)出的多重耐藥菌都對(duì)紅霉素、四環(huán)素有著較高的耐藥性，均高于80%。劉宗保從養(yǎng)豬場(chǎng)和豬肉樣品中分離出102株多重耐藥菌株，其中最常見(jiàn)的是大腸桿菌(Escherichia coli)，其次為檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)以及志賀氏菌(Shigella sp.)，且藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-酰胺類等抗生素耐藥基因分布最廣。

4 結(jié)論

(1)根據(jù)抗性細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果可以看出，斷奶仔豬糞便中四環(huán)素耐藥細(xì)菌所占比例最大，育肥豬糞便中頭孢耐藥細(xì)菌占比最大,而雙重耐藥細(xì)菌主要存在于幼齡仔豬糞便中。(2)在養(yǎng)豬場(chǎng)各生長(zhǎng)階段的豬糞便中，相比較于四環(huán)素，抗頭孢氨芐的耐藥細(xì)菌比例都明顯最高。(3)養(yǎng)豬場(chǎng)幼齡期豬糞便中單一耐藥細(xì)菌及多重耐藥細(xì)菌的比例高于成年期，這與幼齡期抗生素使用量和使用種類有關(guān)。