阮羽萱 鄭添鵬 魏寶陽 劉博宇 阮穎 黃勇

摘要：黑曲霉（Aspergillus niger）是一種常見的病原微生物，極易造成糧食霉變、果實(shí)腐爛等問題，產(chǎn)生的毒素嚴(yán)重危害人體健康。紅樹林作為一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，具有重要的微生物學(xué)資源與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。首先采用常規(guī)細(xì)菌篩選方法分離菌株，通過觀察形態(tài)特征以及16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定。然后通過單因素試驗(yàn)并結(jié)合正交試驗(yàn)確定菌株 Z-2001、R-2008生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)條件，并通過拮抗試驗(yàn)確定Z-2001、R-2008菌株對(duì)黑曲霉的抑制效果。發(fā)現(xiàn) Z-2001、R-2008菌株最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）。Z-2001菌株最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖（2.0%）+蛋白胨（0.8%）+MgSO4·7H2O（0.30%）+牛肉膏（0.3%）+NaCl（0.5%），最佳pH值、溫度、轉(zhuǎn)速分別為8、37 ℃、210 r/min，黑曲霉抑菌率為76.80%。R-2008菌株最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖（2.0%）+酵母粉（2.4%）+MgSO4·7H2O（0.20%）+牛肉膏（0.3%）+NaCl（0.5%），最佳pH值、溫度、轉(zhuǎn)速分別為8、28 ℃、180 r/min，黑曲霉抑菌率為78.70%。結(jié)果表明，Z-2001、R-2008菌株能夠有效抑制黑曲霉生長(zhǎng)，且對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境以及條件要求并不嚴(yán)苛，具有較好的開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞：紅樹林;芽孢桿菌;抗性細(xì)菌;黑曲霉;培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S182;S188+.4 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0133-08

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種重要的植物病原菌，廣泛分布于糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，極易大量繁殖導(dǎo)致糧食霉變。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）統(tǒng)計(jì)，全世界每年大約有3%的糧食因?yàn)槊棺兌荒苁秤?。霉菌腐敗是危害糧食安全儲(chǔ)藏的關(guān)鍵因素[1]。黑曲霉能夠?qū)е聞β榍o腐病、棗果霉?fàn)€病、采后芒果果腐病、花生冠腐病、藍(lán)莓及冬葡萄果實(shí)腐爛、灰棗果實(shí)病害等植物病害[2-3]，由此看來，黑曲霉的防治尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，從陸地向海洋逐漸過渡的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)蘊(yùn)藏著大量的生物資源，張起暢等在東寨港紅樹林淤泥中檢測(cè)出53個(gè)門、909個(gè)屬的微生物類群[4]，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。紅樹林具有的鹽漬化、強(qiáng)酸性、沼澤化等特殊的生態(tài)環(huán)境，使生長(zhǎng)于此的微生物種群及其代謝產(chǎn)物等都具有一定的特異性。目前已知紅樹林微生物中有許多菌株能夠產(chǎn)生具有生物活性的抗性物質(zhì)，其產(chǎn)物肽類化合物、酯類化合物、胞外多糖等已廣泛應(yīng)用于抗生素、免疫抑制劑、蛋白黏合抑制劑、食品添加劑的研制等方面[6-7]。鄭紅蕓等在廣西茅尾海紅樹林根圍淤泥中發(fā)現(xiàn)了具有金黃色葡萄球菌抗性的3株鏈霉菌[8];Chi等發(fā)現(xiàn)了28株對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albican）和新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）有抑制作用的紅樹林真菌[9]。雖然紅樹林微生物資源豐富，發(fā)現(xiàn)的抗性菌種類、數(shù)量日益增多，但少見黑曲霉拮抗的微生物的報(bào)道。

目前對(duì)黑曲霉的防治主要有物理處理法和化學(xué)殺菌法，但這些方法在一定程度上會(huì)對(duì)食物本身或人體造成危害。近年來，生物抑菌劑因其低風(fēng)險(xiǎn)、低成本和高效率等特點(diǎn)已成為當(dāng)今確保食品安全生產(chǎn)的主流方式，應(yīng)用前景日趨廣泛[10]。黑曲霉的生物防治主要集中在植物提取物或抗生素等方面，如茶樹精油中的α-松油醇、萜烯-4-醇，冬青油所含的水楊酸甲酯、肉桂與山蒼子復(fù)合精油均可有效抑制黑曲霉生長(zhǎng)[11-13]，黃曲霉毒素B1（AFB1）能夠高效降解黑曲霉[14]。然而，目前發(fā)現(xiàn)的具有黑曲霉抑制作用的拮抗細(xì)菌較少，解淀粉芽孢桿菌CP 2014 無細(xì)胞提取液有明顯抑制效果[15]，Paenibacillus sp. 512、Brevibacterium sp. 90 等能夠有效防治黑曲霉引起的莖腐病[16]，而食品領(lǐng)域尚未見報(bào)道。

本研究從深圳壩光紅樹林海泥中分離鑒定出2株對(duì)黑曲霉具有顯著抑制效果的細(xì)菌，可能為新菌株，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化并確定了抑菌效果。研究結(jié)果可為充分利用紅樹林微生物資源、制備有效黑曲霉防治生物抑菌劑提供重要資料，具有較好的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集點(diǎn)的概況 樣品的采集點(diǎn)位于深圳壩光紅樹林（114°30′E 、22°39′N），地處深圳市東部龍崗區(qū)銀葉樹（Heritiera littoralis Dryand）濕地公園，此地位置偏遠(yuǎn)，人為破壞與污染較少，附近海灘淺，相對(duì)封閉，水土一直保持較好[17]。該地區(qū)其他動(dòng)植物、微生物資源豐富，具有較高的科研價(jià)值，是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)研究的理想基地。試驗(yàn)材料于2018年6月采集，全部試驗(yàn)工作均在作物表觀遺傳調(diào)控與發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（ND）、酵母液體培養(yǎng)基（YEB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。

1.1.3 主要試劑 DNA聚合酶、dNTPs和引物，均購(gòu)自湖南擎科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 儀，購(gòu)自Bio-Rad 公司;紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海泥微生物多樣性研究及抗菌活性的篩選 取少量海泥勻漿樣品，在無菌試管中進(jìn)行常規(guī)10倍梯度稀釋，從10-5、10-6、10-7 等3個(gè)濃度梯度樣品分別取200 μL稀釋液，分別涂布于LB、NA、PDA、ND固體分離培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3 d后，從平板中挑取典型菌落利用三區(qū)劃線法接種于對(duì)應(yīng)的分離培養(yǎng)基上，獲取純單菌株。挑選已成熟的菌株接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)2 d。選取革蘭氏陰性菌2株[大腸桿菌和變形桿菌（Proteus vulgaris）]，革蘭氏陽性菌3 株[枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌（Sarcine luted）和金黃色葡萄球菌]，真菌1株（黑曲霉）作為敏感指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法[18]進(jìn)行抗菌活性篩選。設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，培養(yǎng)1～2 d，測(cè)量抑菌圈直徑，比較抗菌活性。

1.3.2 菌株的觀察與鑒定 將菌株Z-2001、R-2008接種于LB培養(yǎng)基上，觀察并記錄菌落的各項(xiàng)狀態(tài)，芽孢染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄其結(jié)果。采用常規(guī)方法提取基因組[19]，利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.3.3.1 菌株基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

將活化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中制成種子液。選用LB、PDA、YEB、NA、NB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將等量的種子液分別接種于液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，定期檢測(cè)培養(yǎng)液D600 nm并比較結(jié)果。

1.3.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取活化后的菌株，接種于基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法同上，無菌環(huán)境下每隔2 h取樣1次，檢測(cè)培養(yǎng)液的D600 nm連續(xù)測(cè)量24 h，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3.3 培養(yǎng)基組分種類及濃度優(yōu)化

以NA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同碳源（葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖），氮源（酵母粉、蛋白胨、NH4NO3、KNO3），無機(jī)鹽（NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4+K2HPO4（1 ∶1）復(fù)合鹽、ZnSO4·7H2O）的培養(yǎng)效果。接入3%種子液（3個(gè)重復(fù)），培養(yǎng)及測(cè)量方法同上，篩選出最佳培養(yǎng)基組合[20]。在此基礎(chǔ)上研究碳源（0.10%、0.20%、0.25%、0.40%、1.00%、2.00%），氮源（0.3%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%），無機(jī)鹽（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）濃度對(duì)菌株培養(yǎng)效果的作用，獲得最優(yōu)組分濃度。進(jìn)而采用3因素3水平L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以此確定培養(yǎng)基中各組分的最佳配比[21]。

1.3.3.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果，通過控制初始pH值（6、7、8），溫度（28、37、46 ℃），轉(zhuǎn)速（150、180、210 r/min）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，獲得最佳初始發(fā)酵條件。

1.3.4 菌株的抑菌效果 在超凈工作臺(tái)上，挑取活化后的單菌落接種于最佳配比液體培養(yǎng)基中，按照“1.3.3”節(jié)方法培養(yǎng)12 h，制成種子液。將得到的菌液離心，過濾后留取濾液。分別按照2、4、6、8 mL的濃度梯度，加入到PDA固體培養(yǎng)基中混勻，再將等量黑曲霉接種于PDA平板中間，設(shè)置3組重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)。每天觀察并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)公式算出抑菌率。

菌落生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照生長(zhǎng)直徑-處理生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照生長(zhǎng)直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性菌的篩選

本研究運(yùn)用4 種分離培養(yǎng)基對(duì)采集的海泥進(jìn)行微生物分離，最終獲得58 株純培養(yǎng)物。并用濾紙片法[22]初篩分離的58 株菌株的抗菌活性，除去試驗(yàn)過程中平板被污染以及其他原因無法得到測(cè)試結(jié)果的，發(fā)現(xiàn)有14 株菌株的發(fā)酵液至少對(duì)其中1 株敏感指示菌有不同程度的拮抗作用。在對(duì)獲得的14 株具有拮抗作用的菌株進(jìn)行復(fù)篩時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中有2 株菌株（Z-2001、R-2008）的發(fā)酵液對(duì)黑曲霉具有較強(qiáng)的拮抗作用。

2.2 Z-2001、R-2008菌株的鑒定

由表1、圖1可知，Z-2001、R-2008菌株二者形態(tài)相似，均為芽孢桿菌，呈革蘭氏陽性。根據(jù)測(cè)序結(jié)果和進(jìn)化樹（圖2）分析顯示，Z-2001、R-2008與已知菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能為新種。

2.3 Z-2001、R-2008菌株培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

由圖3可知，Z-2001、R-2008均在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)效果最佳，因此選用NA培養(yǎng)基作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在連續(xù)的24 h內(nèi)每2 h測(cè)定1次菌液濃度，并繪制生長(zhǎng)曲線。由圖4可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上Z-2001、R-2008的生長(zhǎng)曲線均為典型的“S”形曲線，并且都在12 h左右達(dá)到生長(zhǎng)量的高峰。

由圖5可知，Z-2001、R-2008菌株對(duì)葡萄糖的利用能力最強(qiáng)，其次是淀粉。因此筆者所在課題組選用葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳碳源。選取5個(gè)梯度探究葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%時(shí)，Z-2001、R-2008菌體生長(zhǎng)量最大，D600 nm值分別為1.981、2.044。因此發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。

由圖6可知，選取酵母粉、蛋白胨、KNO3、NH4NO3 4種氮源進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)蛋白胨和酵母粉作為氮源時(shí)菌體的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于其他氮源，說明Z-2001、R-2008菌株對(duì)有機(jī)氮源的利用能力更強(qiáng)。原因可能在于有機(jī)氮源中還包含著碳源和少量無機(jī)鹽，而無機(jī)氮源成分相對(duì)簡(jiǎn)單，可能營(yíng)養(yǎng)不足。因而分別選用蛋白胨、酵母粉作為Z-2001、R-2008 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳氮源。選取6個(gè)梯度探究蛋白胨、酵母粉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn) Z-2001 菌株的D600 nm值隨著蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.8%時(shí)D600 nm值達(dá)到峰值，隨后開始緩慢下降，從而確定蛋白胨的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%。R-2008菌株的 D600 nm值在酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～1.0%之間變化不大，當(dāng)達(dá)到1.2%時(shí)D600 nm值達(dá)最大值：1.942，之后D600 nm值開始緩慢下降。因此酵母粉的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%。

由圖7可知，選取NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O以及KH2PO4+K2HPO4（1 ∶1）復(fù)合鹽進(jìn)行無機(jī)鹽篩選。除了鋅離子以外，其他離子都能夠促進(jìn)Z-2001、R-2008菌株的生長(zhǎng)，相比之下鎂離子作用較為明顯，因此2種菌生長(zhǎng)的最佳無機(jī)鹽為MgSO4·7H2O。選取4個(gè)梯度探究最佳無機(jī)鹽離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Z-2001、R-2008菌株的D600 nm值隨MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)于Z-2001菌株來說，鎂離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量處在較高的水平，D600 nm值也達(dá)到了最大值。而R-2008菌株則是在MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于0.4%時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)最高水平。此結(jié)果與孔高飛對(duì)短小芽孢桿菌的研究結(jié)果[23]相似，因此Z-2001菌株的最優(yōu)無機(jī)鹽MgSO4·7H2O最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，R-2008為0.4%。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由以上試驗(yàn)得到了單因素的結(jié)果，而這些組分組合在一起可能會(huì)相互影響，導(dǎo)致培養(yǎng)效果變差，因此需要正交試驗(yàn)來確定各組分配比，正交試驗(yàn)因素和水平見表2。由表3可知，影響Z-2001菌株菌體生長(zhǎng)的因素主次順序?yàn)镸gSO4·7H2O>葡萄糖>蛋白胨，影響R-2008菌株菌體生長(zhǎng)的因素主次順序?yàn)榻湍阜?gt;葡萄糖>MgSO4·7H2O。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，Z-2001與R-2008最佳組合分別為A3B3C2、A3B3C2，而由均值得到的最佳組合分別為A3B2C2、A3B3C1。對(duì)這2種情況分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。因此Z-2001菌株菌體的最適培養(yǎng)基為葡萄糖2.0%、蛋白胨0.8%、MgSO4·7H2O 0.30%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%;R-2008 菌株菌體的最適培養(yǎng)基為葡萄糖2.0%，酵母粉2.4%，MgSO4·7H2O 0.2%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%。

2.5 菌株發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

由圖9-A可知，隨著pH值的不斷增大，Z-2001、R-2008菌株的D600 nm值也隨之增大，在pH值=8時(shí)達(dá)到了最大值。說明Z-2001、R-2008 菌株在弱酸性和中性條件下可以生長(zhǎng)，但偏堿性條件更適宜生長(zhǎng)，因此選擇pH值=8為 Z-2001、R-2008 菌株的最適pH值。

溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，它能夠影響菌體代謝過程中酶的反應(yīng)效率。由圖9-B可知，Z-2001、R-2008菌株在46 ℃培養(yǎng)時(shí)菌體中的酶因?yàn)闇囟冗^高而逐漸失活，菌體生長(zhǎng)量明顯變小，D600 nm值急劇下降，因此在高溫條件下并不適合Z-2001、R-2008的菌株生長(zhǎng)。而Z-2001、R-2008 菌株分別在37、28 ℃時(shí)長(zhǎng)勢(shì)良好，D600 nm值達(dá)到了最大。因此筆者所在課題組選擇 37 ℃作為 Z-2001 菌株的最適溫度，28 ℃作為R-2008菌株的最適溫度。

在搖床的振蕩培養(yǎng)下能夠使氧氣較多地進(jìn)入培養(yǎng)液以供菌株使用，由圖9-C可知，Z-2001、R-2008 菌株分別在轉(zhuǎn)速為210、180 r/min時(shí)D600 nm值最大。因此筆者所在課題組選擇210 r/min為Z-2001菌株的最佳轉(zhuǎn)速，180 r/min為R-2008菌株的最佳轉(zhuǎn)速。

2.6 黑曲霉抗性

將過濾后的2種菌液以不同含量與PDA培養(yǎng)基混合制成帶藥培養(yǎng)基，再將等量黑曲霉接種在平板中央，測(cè)定2種菌對(duì)黑曲霉的抑制率。由圖10可知，隨著發(fā)酵液量的不斷增加其抑制效果逐漸顯現(xiàn)，特別是菌液量在6 mL時(shí)抑制效果變得明顯，8 mL 時(shí)基本可以抑制住黑曲霉孢子的生長(zhǎng)。Z-2001 菌株8 mL的發(fā)酵液對(duì)黑曲霉的抑菌率可達(dá)到76.80%，R-2008菌株8 mL抑菌率可達(dá)到78.70%。

3 討論與結(jié)論

黑曲霉是世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的一類病原微生物，對(duì)人體安全、食品安全產(chǎn)生了極大的威脅。目前，紅樹林是已知生態(tài)系統(tǒng)中種類豐富，高利用率的濕地生態(tài)系統(tǒng)之一[24]，蘊(yùn)含著優(yōu)質(zhì)的微生物資源，許多微生物能產(chǎn)生大量有拮抗活性且效果明顯的代謝物質(zhì)。在現(xiàn)行有效的黑曲霉防治方法中，生物法具有物理、化學(xué)法無法比擬的低投資、低風(fēng)險(xiǎn)、高效率、高收益等優(yōu)勢(shì)。且生物法中大多利用的是植物與微生物，對(duì)環(huán)境友好且不會(huì)產(chǎn)生較大危害。許多植物提取物中含有重要的生物活性物質(zhì)，已有研究表明肉桂提取液、丁香提取物對(duì)黑曲霉均有較強(qiáng)的抑制作用，肉桂抑菌圈直徑可達(dá)17.49 mm，丁香抑菌率可達(dá)50%[25-26]。本研究中，芽孢桿菌 Z-2001、R-2008最大抑菌率分別可達(dá)76.80%、78.70%，相比之下優(yōu)勢(shì)明顯，且經(jīng)過試驗(yàn)，2種菌株大量培養(yǎng)所需條件簡(jiǎn)單，可以認(rèn)為其具有生物抑菌劑的開發(fā)價(jià)值。

微生物的抑菌機(jī)制較為復(fù)雜，一般認(rèn)為芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)主要包括由核糖體組成的化合物和由非核糖體組成的化合物這兩大類[27-28]。這些具有拮抗活性的物質(zhì)能夠使菌絲生長(zhǎng)受阻，產(chǎn)生畸形或推遲分生孢子的萌發(fā)時(shí)間，導(dǎo)致其芽管和菌絲畸形而不能繼續(xù)生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)拮抗作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌Z-2001、R-2008代謝產(chǎn)物對(duì)黑曲霉拮抗效果顯著，但關(guān)于2種菌株抑制黑曲霉的有效成分、作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

Z-2001、R-2008菌株為芽孢桿菌屬，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、成本低。菌株代謝產(chǎn)物能有效抑制黑曲霉菌絲生長(zhǎng)，抑菌作用顯著，最高抑菌率分別達(dá)到76.80%和78.70%。研究結(jié)果可為生物抑菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也可為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]馮蒙蒙.貯藏期間糧食霉變控制方法的研究[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2019（15）：138-139.

[2]黃雪蘭，李菊馨，周海蘭，等. 3種生防真菌對(duì)劍麻莖腐病病菌黑曲霉的抑制效果[J]. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2019，32（1）：16-20.

[3]陳 燕，張 健，魏 佳，等. 一氧化氮熏蒸抑制干制灰棗黑曲霉病及貯藏品質(zhì)保持[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35（12）：297-303.

[4]張起暢，張文飛，殷浩能，等. 宏基因組測(cè)序分析東寨港紅樹林淤泥和水體微生物的多樣性[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2020，39（1）：116-122.

[5]Tanner M K，Moity N，Costa M T，et al. Mangroves in the Galapagos：ecosystem services and their valuation[J]. Ecological Economics，2019，160：12-24.

[6]徐志勇，馮 昭，徐 靜.紅樹林微生物抗菌活性成分研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2017，42（4）：241-254.

[7]Balakrishnan B，Ranishree J K，Thadikamala S，et al. Purification，characterization and production optimization of a vibriocin produced by mangrove associated Vibrio parahaemolyticus[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2014，4（4）：253-261.

[8]鄭紅蕓，吳 越，葉景靜，等. 三株紅樹林來源鏈霉菌的鑒定及抗菌活性研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2019，35（7）：985-990.

[9]Chi W C，Pang K L，Chen W L，et al. Antimicrobial and iNOS inhibitory activities of the endophytic fungi isolated from the mangrove plant Acanthus ilicifolius var. xiamenensis[J]. Botanical Studies，2019，60（1）：4.

[10]魏 晨，郭永鵬，計(jì) 成，等. 黃曲霉毒素生物降解技術(shù)在反芻動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用前景[J]. 飼料工業(yè)，2018，39（19）：60-64.

[11]安培培.茶樹精油對(duì)采后葡萄黑曲霉和赭曲霉的抑制效果及作用機(jī)理研究[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2019.

[12]閆 佳，牛延菲，史正軍，等. 滇產(chǎn)5種植物精油的抑菌性能及其成分分析[J]. 林業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，6（1）：98-104.

[13]盧 錕，唐雅珂，龔吉軍，等. 不同植物精油對(duì)大米青霉和黑曲霉的抑菌效果[J]. 食品工業(yè)科技，2020，41（3）：110-113，119.

[14]Qiu T Y，Wang H M，Yang Y，et al. Exploration of biodegradation mechanism by AFB1-degrading strain Aspergillus niger FS10 and its metabolic feedback[J]. Food Control，2021，121：107609.

[15]賈瑞娟.山西老陳醋源芽孢菌抑菌機(jī)理及對(duì)腐敗菌群體感應(yīng)抑制的研究[D]. 太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[16]Barbosa L O，Lima J S，Magalhes V C，et al. Compatibility and combination of selected bacterial antagonists in the biocontrol of sisal bole rot disease[J]. BioControl，2018，63（4）：595-605.

[17]鄧太陽，趙丹陽，邱華龍，等. 深圳壩光銀葉樹濕地園林木有害生物調(diào)查及防控[J]. 林業(yè)與環(huán)境科學(xué)，2019，35（1）：54-60.

[18]譚才鄧，朱美娟，杜淑霞，等. 抑菌試驗(yàn)中抑菌圈法的比較研究[J]. 食品工業(yè)，2016，37（11）：122-125.

[19]王 偉，王玉琢，舒 鵬，等. 16S核糖體DNA宏基因組測(cè)序中細(xì)菌核酸提取方法的比較研究[J]. 生物技術(shù)通訊，2015，26（4）：551-555.

[20]焉兆萍，宋士良，陸克文.枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 國(guó)外畜牧學(xué)（豬與禽），2019，39（1）：51-55.

[21]鄒玉葉.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選教學(xué)方法的應(yīng)用研究[J]. 科教導(dǎo)刊，2018（16）：108-111.

[22]李小俊，成麗霞，吳彥彬，等. 拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測(cè)定的新方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：55-58.

[23]孔高飛.一種短小芽孢桿菌分離鑒定及培養(yǎng)條件研究[D]. 杭州：浙江理工大學(xué)，2014.

[24]劉慧杰，張虎山，田 蘊(yùn)，等. 紅樹林濕地微生物對(duì)主要污染物的凈化作用[J]. 廣州環(huán)境科學(xué)，2013，28（1）：9-17.

[25]張 煒，吳正云，羅 力，等. 藥食兩用植物提取液對(duì)李果實(shí)采后常見致腐真菌抑制作用[J]. 中國(guó)釀造，2019，38（3）：166-169.

[26]蔣志國(guó)，施瑞城.10種中草藥提取物對(duì)常見果蔬致腐真菌的抑制作用及有效成分分析[J]. 食品科技，2006，31（4）：68-71.

[27]李琪敏，周婷婷，秦春秀，等. 枯草芽孢桿菌HAB-8菌株分離篩選鑒定及抑菌機(jī)理初步研究[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019（2）：28-36.

[28]吳海霞，田志芳. 銀杏果實(shí)（白果）多糖提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36（6）：1551-1558.

[29]劉振宇，柳韶華，趙春青，等. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)桑炭疽病菌的抑制作用[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（4）：409-412.