胡相卡，劉作棟，趙苗鑫，董蘇敏，楊鶴，劉曉娟，馬悅，代春美

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001)

糖尿病是一種以血糖高為特點的復(fù)雜的代謝紊亂性疾病，據(jù)估計，在20～79歲的成年人中，2019年有420萬人死于糖尿病，約占全球死亡人數(shù)的11.3%[1]。隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的變化以及人口老齡化的加劇，糖尿病的發(fā)生率、致殘率及致死率有逐年升高的趨勢，常涉及各種與微血管和大血管有關(guān)的并發(fā)癥[2]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)和腎功能衰竭的重要原因[3]。DN的病理改變涉及多個方面，包括嚴重白蛋白尿、腎小球基底膜增厚、腎小球及腎小管肥大、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化等[4]。越來越多的流行病學(xué)和臨床前證據(jù)表明炎癥反應(yīng)與DN的發(fā)生和進展密切相關(guān)[5]，炎癥反應(yīng)的激活被認為是腎小球系膜病變的特征，在DN的發(fā)病機制中起著重要作用，如趨化因子、細胞因子和粘附因子等促炎因子，它們在DN中過度表達[6-7]。腎小球系膜細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)在DN病變發(fā)生中作為一種纖維化因子起著重要的作用[8]。因此，了解炎癥反應(yīng)和致纖維化因子在DN進展中的機制將有助于識別新的潛在靶點，并有助于創(chuàng)新治療DN策略的設(shè)計。

目前，血糖控制和腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑的藥物治療不能有效阻止DN的進展[9]。越來越多的證據(jù)表明，中藥治療DN可改善高血糖和蛋白尿，阻斷ESRD進展[9]。因此，探尋適合于DN患者終身服用的中藥，具有重要意義和研究價值。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-Epigallocatechin gallate，EGCG)廣泛存在于綠茶、五倍子、沒食子、柯子等藥用植物中，是綠茶兒茶素化合物中含量最多、生物活性最強的化合物之一[10]。以往的研究表明EGCG對DN小鼠和大鼠有保護作用，但其作用機制主要集中在抗氧化應(yīng)激上[10-13]。本研究主要從抑制致纖維化因子及炎癥反應(yīng)兩方面來探討EGCG對糖尿病大鼠腎臟的保護作用，為中藥治療糖尿病腎病的臨床開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

EGCG購買于寧波禾普生物科技有限公司(批號：20160608)，純度 ≥ 95%，其結(jié)構(gòu)見圖1。其高效液相色譜圖由廠家提供，見圖2。

圖1 EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 EGCG的高效液相色譜圖

1.2 動物

雄性SD大鼠30只，體重(267±17)g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2017-0801。經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準，倫理審查編號為2016013，自覺遵守實驗動物福利倫理原則，在錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，分籠飼養(yǎng)，室溫20 ℃～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h光照周期，自由飲水。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，CAS：1888-3-664，美國，Sigma)；轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)抗體購買于南京建成生物工程研究所；葡萄糖試劑盒、甘油三酯(Triglyceride，TG)試劑盒、膽固醇(Cholesterol，CHO)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)試劑盒、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；細胞間粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)抗體、血管粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)抗體購買于Abcam。

1.4 儀器

德國 Leica RM2235 型石蠟切片機；BIO-RAD 680型全自動酶標儀；80-2離心機；XD-101倒置顯微鏡；奧林巴斯AU5400全自動生化分析儀。

1.5 方法

1.5.1 實驗動物分組及給藥[14]

30只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機抽取6只大鼠為正常對照組(Control)。其余24只大鼠一次性腹腔注射檸檬酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 4.5)新鮮配置的STZ(65 mg·kg-1)溶液，正常對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。7 d后測得空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)值 ≥ 16.7 mmol·L-1的大鼠為糖尿病大鼠模型。將造模成功的24只大鼠隨機分為模型組(DM)、EGCG 10 mg·kg-1·d-1(EL)、20 mg·kg-1·d-1(EM)和40 mg·kg-1·d-1(EH)劑量組，每組6只，EGCG各給藥組大鼠按照上述劑量給藥，模型組和對照組大鼠給予三蒸水，各組大鼠給藥體積均為10 mL·kg-1·d-1。所有動物自由進食、飲水。

1.5.2 標本收集與處理

給予EGCG治療后于第0周、第6周、第12周，記錄各組大鼠的攝食量、飲水量及體重。EGCG治療12周后，收集各組大鼠24 h 尿液，測尿蛋白；乙醚吸入麻醉后，進行眼靜脈取血，離心(4 ℃，3 500 r·min-1，10 min)，收集上清液，按照葡萄糖試劑盒、TG試劑盒、CHO試劑盒說明書分別檢測大鼠血清中FBG、TG、CHO水平，全自動生化分析儀檢測大鼠血清中血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿素氮(BUN)，按照IL-6試劑盒說明書、TNF-α試劑盒說明書采用ELISA法分別檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α水平；所有大鼠在麻醉下處死，迅速取出腎臟，稱取雙側(cè)腎臟重量，計算腎臟指數(shù)，一側(cè)腎臟保存于-80 ℃冰箱，另一側(cè)腎置于4%多聚甲醛溶液中固定。

腎臟指數(shù)/g·kg-1= 兩腎質(zhì)量(g)/體重(kg)。

1.5.3 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察[7]

甲醛固定組織后脫水浸蠟，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)變化。

1.5.4 免疫組織化學(xué)

石蠟組織切片，經(jīng)過二甲苯、不同梯度的酒精脫蠟后，用0.1 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液(pH 4.4)140 ℃進行抗原修復(fù)2 min，再自然冷卻到室溫。用PBS緩沖液洗滌，用新鮮配制的3% H2O2在室溫下處理15 min，PBS洗滌，滴加10%的正常山羊血清封閉液，滴加TGF-β1(1∶500)、ICAM-1(1∶500)、VCAM-1(1∶500)抗體，在4 ℃冰箱中過夜。PBS洗滌，滴生物素標記的二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。用已知陽性切片在同一條件下染色作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片在200倍視野下隨機挑選6個部位拍照，以棕黃色作為判斷陽性表達的標準，并應(yīng)用image J軟件分析同視野下陽性細胞與總細胞數(shù)的比值作為TGF-β1、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達陽性率。

1.5.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體重、飲水量和攝食量的影響

如圖3所示，與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠在造模成功后第6周和第12周體重下降(P< 0.01)、飲水量增加(P< 0.01)、攝食量增加(P< 0.05)。與模型組大鼠相比，給予大鼠EGCG后6周，EGCG各給藥組體重增加(P< 0.01)，飲水量下降(P< 0.01)；給予EGCG后12周，EGCG 10、20 mg·kg-1·d-1劑量組大鼠飲水量低于模型組(P< 0.01)，EGCG 40 mg·kg-1·d-1劑量組大鼠體重高于模型組(P< 0.01)，飲水量、攝食量低于模型組(P< 0.01)，以上結(jié)果說明了EGCG可以改善糖尿病大鼠的體重、飲水量和攝食量等一般體征。

A、B、C：大鼠的體重(A)、飲水量(B)和攝食量(C)；Control：正常對照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。圖3 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體重、飲水量和攝食量的影響

2.2 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中FBG、TG和CHO水平的影響

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠血清中FBG、TG和CHO水平在造模成功后第12周后升高(P< 0.01)。

與模型組大鼠相比，EGCG治療12周后，EGCG各給藥組大鼠血清中FBG、TG和CHO水平降低(P< 0.01)，說明了EGCG能夠使糖尿病大鼠血清中FBG、TG和CHO的水平向正常水平恢復(fù)(圖4)。

A、B、C：大鼠的FBG(A)、TG(B)和CHO(C)；Control：正常對照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。圖4 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠FBG、TG和CHO的影響

2.3 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎重和腎臟指數(shù)的影響

如圖5所示，與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠腎重和腎臟指數(shù)增加(P< 0.01)。與模型組大鼠相比，給予糖尿病大鼠EGCG 12周后，EGCG各給藥組大鼠腎重和腎臟指數(shù)下降(P< 0.01)。

A、B：大鼠的腎重(A)和腎指數(shù)(B)；Control：正常對照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。圖5 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎重和腎指數(shù)的影響

2.4 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠24 h尿蛋白、Scr和BUN的影響

如圖6所示，與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠24 h尿蛋白增加(P< 0.01)，血清中Scr和BUN增加(P< 0.01)。與模型組大鼠相比，給予糖尿病大鼠EGCG 12周后，EGCG各給藥組大鼠24 h尿蛋白和血清中BUN下降(P< 0.05)，EGCG 20、40 mg·kg-1·d-1劑量組大鼠血清中Scr下降(P< 0.01)，說明了EGCG對糖尿病大鼠腎功能具有改善作用。

2.5 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織形態(tài)的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠腎小管上皮細胞腫脹，在胞漿內(nèi)出現(xiàn)邊界清晰的巨大空泡，為空泡樣病變，給予EGCG 12周后，EGCG 10、20 mg·kg-1·d-1劑量組大鼠腎小管上皮細胞空泡樣病變有所改善，EGCG 40 mg·kg-1·d-1劑量組大鼠腎小管上皮細胞空泡樣病變明顯得到改善，幾乎看不到腎小管上皮細胞空泡樣病變發(fā)生，說明了EGCG 能夠改善糖尿病大鼠腎小管上皮細胞空泡樣病變(圖7)。

A、B、C：大鼠的24 h尿蛋白(A)、Scr(B)和BUN(C)；Control：正常對照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。圖6 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠24 h尿蛋白、Scr和BUN的影響

I：正常對照；II：糖尿病模型；III：EGCG 10 mg·kg-1·d-1；IV：EGCG 20 mg·kg-1·d-1；V：EGCG 40 mg·kg-1·d-1。圖7 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織形態(tài)的影響(HE染色，×200)

2.6 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中IL-6和TNF-α的影響

如圖8所示，與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平升高(P< 0.01)，與模型組大鼠相比，給予糖尿病大鼠EGCG 12周后，EGCG各給藥組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低(P< 0.05)，說明了EGCG可降低糖尿病大鼠血清中促炎因子IL-6和TNF-α的水平。

A、B：大鼠血清中的IL-6(A)和TNF-α(B)；Control：正常對照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。圖8 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中的IL-6和TNF-α的影響

2.7 EGCG對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎組織中TGF-β1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達影響

與對照組相比，模型組腎組織中TGF-β1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達增加(P< 0.01)(圖9、圖10)。給予EGCG 12周后，與模型組相比，EGCG各給藥組腎組織中TGF-β1、ICAM-1蛋白表達下降(P< 0.01)，說明了EGCG可下調(diào)糖尿病大鼠腎組織中致纖維因子TGF-β1和粘附因子ICAM-1的表達。

I：正常對照；II：糖尿病模型；III：EGCG 10 mg·kg-1·d-1；IV：EGCG 20 mg·kg-1·d-1；V：EGCG 40 mg·kg-1·d-1。圖9 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ICAM-1和 VCAM-1蛋白的表達情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)

A、B、C：大鼠腎組織中TGF-β1(A)、ICAM-1(B)和 VCAM-1(C)蛋白的表達情況；Control：正常對照，DM：糖尿病模型，EL：EGCG 10 mg·kg-1·d-1，EM：EGCG 20 mg·kg-1·d-1，EH：EGCG 40 mg·kg-1·d-1；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。圖10 EGCG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織中TGF-β1、ICAM-1和 VCAM-1蛋白表達的影響

3 討論

DN是糖尿病的一種嚴重并發(fā)癥，飲食習(xí)慣在決定糖尿病相關(guān)疾病的發(fā)生和進展中起著重要作用，適當(dāng)?shù)娘嬍?富含水果和蔬菜)可以延遲或預(yù)防糖尿病發(fā)病過程，多酚和富含多酚食物攝入量的增加與糖尿病發(fā)病率及其相關(guān)并發(fā)癥的降低有關(guān)[15]。EGCG是綠茶中主要的多酚成分，本實驗結(jié)果顯示，給予EGCG 12周后，糖尿病大鼠體重增加，攝食量、飲水量下降，24 h尿蛋白減少，血清中FBG、TG、CHO、Scr、BUN水平下降，腎小管上皮細胞空泡樣病變得到改善，說明了EGCG對糖尿病大鼠的一般體征、血糖、血脂、膽固醇水平及腎功能具有改善作用。

DN發(fā)病機制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、慢性炎癥、間質(zhì)纖維化等對DN的發(fā)展都有很大的促進作用。因此，抑制氧化應(yīng)激、慢性炎癥、間質(zhì)纖維化是防治DN的一個重要策略。研究發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制DN大鼠的高血糖、蛋白尿和脂質(zhì)過氧化，降低腎臟晚期糖基化終末產(chǎn)物的積累及其在腎皮質(zhì)中相關(guān)蛋白的表達，改善相關(guān)病理狀況、腎損傷和糖毒性，從而減輕因糖代謝相關(guān)氧化應(yīng)激異常引起的腎損傷[13]。EGCG通過在多個階段激活核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號通路，下調(diào)KELCH樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Recombinant Kelch Like ECH Associated Protein 1，Keap1)、破壞Nrf2-Keap1相互作用來提高Nrf2的核水平緩解DN的進展[10,12]。EGCG通過激活二?；视图っ甫?diacylglycerol kinase α，DGKα)改善DN小鼠蛋白尿等腎臟病理變化[11]。這些研究表明EGCG主要通過抗氧化應(yīng)激來抑制DN的進展，可能與其結(jié)構(gòu)中的沒食子酸酯部分和4'-OH密切相關(guān)[16]。研究表明EGCG能使異位氣管移植閉塞性細支氣管炎小鼠的中性粒細胞和巨噬細胞浸潤明顯減少、參與中性粒細胞募集的炎癥細胞因子TNF-α和促纖維化細胞因子TGF-β1降低[17]，抑制脂多糖刺激的小鼠血清中炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的釋放[18]，下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)人主動脈內(nèi)皮細胞中ICAM-1的表達[19]以及尿酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中ICAM-1和TNF-α mRNA的表達[20]，表明了EGCG的抗炎和抗纖維化作用，可能與其結(jié)構(gòu)中的烯酮密切相關(guān)[21]。然而EGCG是否通過抑制炎癥反應(yīng)和致纖維化因子來緩解DN的進展，目前還不清楚。本實驗主要針對纖維化及炎癥兩方面進行了研究。

致纖維化因子TGF-β1通過多種分子介質(zhì)和細胞內(nèi)信號通路在DN的發(fā)展過程中起著核心作用[8]。血糖水平的升高可通過多種機制使TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和翻譯上調(diào)，異常細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和代謝、氧化應(yīng)激和非酶糖基化增加等是TGF-β1在糖尿病病情中上調(diào)的關(guān)鍵途徑[14]。因此，抑制TGF-β1蛋白的表達也是治療DN的一種有效手段。本實驗結(jié)果顯示，EGCG可降低糖尿病大鼠腎組織中TGF-β1蛋白的表達量，說明了EGCG可能是通過抑制致纖維化因子TGF-β1來改善糖尿病大鼠腎臟損傷。

研究表明DN是一種炎癥性疾病，促炎細胞因子、趨化因子和粘附因子可能與糖尿病腎臟病變中的局部損傷有關(guān)，在DN的發(fā)病機制中起著重要作用，如促炎因子TNF-α、IL-6及粘附因子ICAM-1和VCAM-1，在DN中過度表達[22-23]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)，在高血糖引起的腎損傷中起重要作用，IL-6是一種重要的炎性細胞因子，在DN大鼠腎臟中顯著升高[24]。細胞粘附因子VCAM-1和ICAM-1在DN中表達增加，而且在DN炎癥反應(yīng)中起著重要作用，已引起越來越多的關(guān)注，有研究還報道ICAM-1和VCAM-1的表達水平隨DN中促炎因子的增加而增加[25-26]。因此，關(guān)注炎癥反應(yīng)對抑制DN的發(fā)展具有重要意義。本實驗結(jié)果顯示EGCG可使糖尿病大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低，腎組織中ICAM-1的蛋白表達量降低，但對VCAM-1的蛋白表達影響不大，有待進一步研究，說明了EGCG可能是通過抑制促炎因子TNF-α、IL-6及粘附因子ICAM-1來改善糖尿病大鼠腎臟損傷。

綜上，本實驗結(jié)果表明EGCG對糖尿病大鼠腎臟具有保護作用，其機制可能與抑制致纖維化因子TGF-β1、促炎因子TNF-α和IL-6及粘附因子ICAM-1有關(guān)，為中藥治療糖尿病腎病的臨床應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。