孫暢，姚兆群，曹小蕾，卞鵬軒，劉倩倩，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

甜瓜(CucumismeloL.)是重要的園藝類水果作物，其果實(shí)深受各國消費(fèi)者喜愛，是新疆特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，2019年種植面積57.76 khm2，總產(chǎn)量達(dá)215.6萬t[1]。分枝(瓜)列當(dāng)(PhelipancheaegyptiacaPers)是新疆部分甜瓜產(chǎn)區(qū)的主要威脅，輕者導(dǎo)致甜瓜大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)絕收[2-3]。瓜列當(dāng)具有種子庫龐大、種子微小、休眠時(shí)間長及植株通過吸器與寄主植物維管束連接等特點(diǎn)，導(dǎo)致難以防治[4]。吸器是寄生植物連接寄主的橋梁和通道，具有連接、侵入并從寄主獲取各種物質(zhì)的功能，同時(shí)也是寄生植物與寄主進(jìn)行sRNAs、mRNAs、病毒、糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)交流的場所[5-8]。目前對分枝(瓜)列當(dāng)甜瓜寄生體系中miRNAs在吸器中的轉(zhuǎn)移情況及轉(zhuǎn)移miRNAs的功能了解較少。

microRNA(miRNA)是植物體內(nèi)普遍存在的一類內(nèi)源性單鏈20～40 nt非編碼RNA，其在植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及脅迫響應(yīng)等方面的都發(fā)揮重要調(diào)控作用，甚至可跨界調(diào)控其他物種體內(nèi)基因的表達(dá)[9-12]。Shahid等[6]報(bào)道菟絲子miRNA能通過吸器轉(zhuǎn)移到與其聯(lián)接的寄主的莖，并干擾寄主miRNA和phasiRNA表達(dá)。Betti等[9]發(fā)現(xiàn)施加外源miRNA可以引發(fā)靶基因的沉默和受體植物表型的改變。此外，在植物受病毒、真菌及昆蟲危害時(shí)，植物miRNA表達(dá)量會顯著改變，這些miRNA可能參與了植物免疫反應(yīng)[13-15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)棉花miR159和miR166在感染黃萎病菌后轉(zhuǎn)移至大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb)中，通過結(jié)合和沉默與毒力相關(guān)的蛋白HIC-15(異毛菌素C-15羥化酶)和CLP-1(Ca2+半胱氨酸蛋白酶)增強(qiáng)棉花對大麗輪枝菌的抗性。Wang等[17]研究表明小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)的Pst-milR1在侵染小麥時(shí)轉(zhuǎn)移至小麥體內(nèi)，通過結(jié)合Pr2參與跨域RNA干擾，從而降低小麥抗性。列當(dāng)在寄生寄主植物的過程中不僅從寄主中吸取營養(yǎng)物質(zhì)同樣也存在大分子物質(zhì)和寄主基因的轉(zhuǎn)移[5,18]。本試驗(yàn)以分枝(瓜)列當(dāng)甜瓜寄生體系為研究對象，分別對寄生有瓜列當(dāng)?shù)奶鸸细?、瓜列?dāng)寄生于甜瓜的寄生部位和列當(dāng)莖稈取樣，以未接種列當(dāng)?shù)奶鸸细繛閷φ?，進(jìn)行sRNA測序，以期篩選出瓜列當(dāng)在寄生甜瓜過程中的miRNA，為進(jìn)一步揭示瓜列當(dāng)?shù)募纳肿訖C(jī)制、甜瓜抗性分子機(jī)制及甜瓜抗性遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株甜瓜品種“黃旦子”種子購買于新疆昌吉市益豐種苗有限責(zé)任公司，瓜列當(dāng)植株及種子采集于塔城地區(qū)額敏縣，已鑒定為分枝(瓜)列當(dāng)。

1.2 植物處理和取樣

在混有蛭石和沙子(1∶1)基質(zhì)的花盆(口徑：16 cm，高度：12.5 cm)中拌入瓜列當(dāng)種子0.02 g，用水浸透，每盆播種1～2粒提前浸泡露白的甜瓜種子，以未拌入瓜列當(dāng)種子處理作為對照，各10次重復(fù)。將播種好的各處理盆栽隨機(jī)擺放，置于溫室中培養(yǎng)(溫度28 ℃，光照度為10 000 lx，光照時(shí)長16 h·d-1，黑暗8 h·d-1)，正常澆水管理。于瓜列當(dāng)剛出土?xí)r用蒸餾水迅速洗根進(jìn)行取樣，分別選取被寄生的甜瓜根系(MR)、瓜列當(dāng)寄生部位(MC)、寄生點(diǎn)上方2～3 cm的列當(dāng)莖稈(MP)和未接種的對照甜瓜根部(MK)4部分，取樣時(shí)期與部位見圖1，各樣品3個(gè)重復(fù)，取樣后將樣品組織置于液氮中速凍后存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Small RNA文庫構(gòu)建和測序

用EasyPure?Plant RNA 提取試劑盒(全式金公司)提取樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性，并用超微量核酸蛋白分析儀定量檢測RNA的濃度。采用Small RNA Sample Pre Kit試劑盒(武漢錦奧生物科技有限公司)構(gòu)建文庫，庫檢合格后交由北京諾禾致源科技股份有限公司使用Illumina SE50 進(jìn)行sRNA測序。

A:生長45 d的對照甜瓜植株；B：生長45 d接種列當(dāng)?shù)奶鸸现仓?；C：A圖洗根后的取樣圖示，MR：列當(dāng)寄生甜瓜根；MC：列當(dāng)寄生點(diǎn)；MP：列當(dāng)莖稈。圖1 樣品取樣時(shí)期與部位

1.4 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Illumina Casava 1.8檢查數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率，堿基位置測序錯(cuò)誤率低于0.5%視為合格。用Cutadapt 1.9.1(https:∥cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html)去除原始數(shù)據(jù)中含polyA/T/G/C、質(zhì)量值sQ ≤20、未知堿基N的比例大于10%的低質(zhì)量reads及接頭(5’端接頭5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’;3’端接頭5’-AGATACGGAAGAGCACACGTCT-3’)序列，并對過濾后的clean reads進(jìn)行18～22 nt長度篩選。采用bowtie 1.3.0(http:∥bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml)將長度篩選后的miRNA定位到甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(Melon v3.6.1 Genome)中進(jìn)行比對，獲取已知miRNA的二級結(jié)構(gòu)，各樣本中miRNA的序列、長度及表達(dá)量等信息。利用mirDeep2 2.0.0.2(https:∥github.com/rajewsky-lab/mirdeep2.gitmirdeep2.0.0.2)根據(jù)前體序列預(yù)測新miRNA并獲取其二級結(jié)構(gòu)等信息。

1.5 miRNA篩選

篩選寄生甜瓜根(MR)、寄生部位(MC)、瓜列當(dāng)莖稈(MP)及未寄生甜瓜根(MK)測序結(jié)果中同時(shí)存在的miRNA，至甜瓜基因組(Melon v3.6.1 Genome)中比對，選取mapping成功且測序結(jié)果表達(dá)量>10的miRNA，用bowtie2 2.3.4.1(http:∥bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)將其映射至瓜列當(dāng)基因組(本課題組前期測序)中，從中篩選unmapping的miRNA，即甜瓜轉(zhuǎn)移至瓜列當(dāng)?shù)膍iRNA。此外篩選寄生甜瓜根(MR)、寄生部位(MC)、瓜列當(dāng)莖稈(MP)及未寄生甜瓜根(MK)測序結(jié)果中同時(shí)存在，而寄生甜瓜根(MR)中沒有的miRNA，將其在瓜列當(dāng)基因組中進(jìn)行比對，選取mapping成功且測序結(jié)果表達(dá)量>10的miRNA，利用bowtie2將其映射至甜瓜基因組(Melon v3.6.1 Genome)中，從中篩選unmapping的miRNA，即瓜列當(dāng)轉(zhuǎn)移至甜瓜的miRNA。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證

樣品總RNA經(jīng)DNase I處理后，利用RransScriptGreen miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒(全式金公司)合成cDNA，20 μL反應(yīng)體系：Total RNA(100 ng·μL-1)2 μL；TransScript miRNA RT Enzyme Mix 1 μL；2×TS miRNA Reaction Mix 10 μL；RNase-free Water 7 μL。反應(yīng)條件：37 ℃孵育1 h，85 ℃處理5 s。隨機(jī)選取差異miRNA，通過Primer 5.5.0(http:∥www.premierbiosoft.com/primerdesign/)軟件設(shè)計(jì)引物，引物詳情見表1。通過ABI Prism 7500定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，20 μL反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、2×PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 10 μL、特異性上游引物(10 μM)0.4 μL、Universal miRNA qPCR Primer(10 μM)0.4 μL、Passive Reference Dye(50×) 0.4 μL、Nuclease-free Water 6.8 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃擴(kuò)增5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，55 ℃復(fù)性15 s。以U6-3(LOC103502534)基因?yàn)閮?nèi)參[19]，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，采用 2-△△CT法[20]計(jì)算各樣品中目標(biāo)miRNA的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 sRNA測序結(jié)果與分析

經(jīng)Illumina SE50平臺測序共構(gòu)建12個(gè)甜瓜sRNA文庫，獲得15 991 946條raw reads，經(jīng)質(zhì)控后共獲得了156 832 594條clean reads，各樣本的Q20>99%，Q30>96%，GC含量范圍為48.93%～54.66%，測序錯(cuò)誤率占比0.01%，低質(zhì)量讀數(shù)平均占比0.17%。長度篩選后各文庫sRNA占比為63.89%，平均序列長度為22 nt(圖2)。對sRNA進(jìn)行注釋后共獲得495 255條已知miRNA和13 370條新的miRNA，總miRNA的占比8.2%，仍有22.01%的sRNA在甜瓜基因組中未注釋，表明有大量sRNA有待挖掘(表2)。

MR：列當(dāng)寄生甜瓜根；MC：列當(dāng)寄生點(diǎn)；MP：列當(dāng)莖稈。圖2 樣品sRNA長度分布頻率

表2 sRNA注釋數(shù)量統(tǒng)計(jì)及占比結(jié)果

2.2 miRNA的注釋分析

以miRBase數(shù)據(jù)庫對miRNA進(jìn)行注釋分析，顯示12個(gè)文庫中除MP外的9個(gè)文庫新miRNA種類比已知miRNA更豐富(圖3A)，說明有待研究注釋的miRNA較多。本研究共注釋到216個(gè)miRNA，這些miRNA分別隸屬于13個(gè)miRNA家族，內(nèi)部成員包含1～6個(gè)不等，其中以MIR399家族成員最多，該家族主要與磷酸鹽信號通路相關(guān)[21]，包含cme-miR399a、cme-miR399b、cme-miR399c、cme-miR399d、cme-miR399e、cme-miR399f和cme-miR399g共6個(gè)成員(圖3C)。對miRNA二級結(jié)構(gòu)和miRNA的堿基偏好性進(jìn)行預(yù)測和分析表明，miRNA前體具有莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)、3’端有2 nt的懸垂(圖3B)，且堿基1位對U有強(qiáng)偏好，10位對A有較強(qiáng)偏好(圖3D)，符合miRNA的堿基偏好性規(guī)律，說明測序得到的miRNA質(zhì)量和可信度均較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

A：不同樣品已知及新miRNA種類；B：miRNA二級結(jié)構(gòu)示意圖，整個(gè)序列是miRNA前體，紅色突出部分為成熟體序列；C：樣品中miRNA家族成員及其成員數(shù)；D：miRNA堿基偏好性示意圖。圖3 miRNA注釋結(jié)果分析

2.3 差異miRNA及靶基因富集分析

植物遭受生物脅迫時(shí)會啟動自身的免疫防御系統(tǒng)，通過對病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein，PR蛋白)、和抗病基因(resistance gene，R基因)的調(diào)控阻止有害生物脅迫[22]。高通量測序篩選生物脅迫中產(chǎn)生的差異基因，并對其靶基因進(jìn)行注釋和分析，可以快速預(yù)測差異基因的生物學(xué)功能，從而進(jìn)一步了解植物的抗生物脅迫的分子過程。對MR和MK的miRNA差異表達(dá)分析結(jié)果表明，與MK相比，MR共產(chǎn)生了35個(gè)差異miRNA，包括19個(gè)已知miRNA和16個(gè)新miRNA，其中17個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)，主要參與LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和谷胱氨態(tài)還原酶的產(chǎn)生；18個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)(圖4)，主要參與介導(dǎo)脫落酸(ABA)與赤霉素(GA)信號、轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生和DCL酶的合成。表明甜瓜可能通過這些差異miRNA介導(dǎo)寄主的防御相關(guān)激素和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來抵御列當(dāng)?shù)募纳?/p>

橫坐標(biāo)表示甜瓜被瓜列當(dāng)寄生后的miRNA表達(dá)倍數(shù)變化(log2FoldChange，P<0.05)；縱坐標(biāo)表示表達(dá)差異的顯著性水平(log10 p-value，P<0.05)；表達(dá)上調(diào)miRNA用紅色點(diǎn)表示，下調(diào)miRNA用藍(lán)色點(diǎn)表示，灰色點(diǎn)為未發(fā)生顯著變化。圖4 甜瓜被瓜列當(dāng)寄生后差異miRNA火山圖

對瓜列當(dāng)-甜瓜寄生系統(tǒng)中的差異基因的靶基因進(jìn)行GO富集，顯示這些靶基因參與了1 547個(gè)生物學(xué)功能條目，368個(gè)細(xì)胞組分條目和785個(gè)分子功能條目，離子結(jié)合(ion binding)、雜環(huán)化合物結(jié)合(heterocyclic compound binding)、結(jié)合(binding)、有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合(organic cyclic compound binding)、銅離子結(jié)合(copper ion binding)5個(gè)分子功能條目顯著富集，其中binding條目富集靶基因最多，有1 045個(gè)靶基因(圖5)，表明甜瓜在被瓜列當(dāng)寄生后通過分子功能中涉及寄生和發(fā)育相關(guān)化合物基因的表達(dá)啟動植物免疫反應(yīng)調(diào)控通路。

橫坐標(biāo)為GO功能條目，縱坐標(biāo)為差異基因數(shù)量。圖5 差異miRNA靶基因GO功能注釋圖

對差異基因的靶基因進(jìn)行KEGG富集，顯示相關(guān)靶基因在油菜素內(nèi)酯的生物合成(Brassinosteroid biosynthesis)、丙酸代謝(Propanoate metabolism)、乙醚脂質(zhì)代謝(Ether lipid metabolism)、mRNA監(jiān)測途徑(mRNA surveillance pathway)、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)、脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism)、磷酸肌醇代謝(Inositol phosphate metabolism)、晝夜節(jié)律-植物(Circadianrhythm-plant)中極顯著富集，在胞吞作用(Endocytosis)、亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)、α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、剪切體(Spliceosome)和嘌呤代謝(Purine metabolism)中顯著富集(圖6)。其中油菜素內(nèi)酯作為一種多羥基甾體植物激素，不僅在植物的生長、發(fā)育和對不同環(huán)境脅迫的反應(yīng)中起著重要作用[23]，還能夠通過降低H2O2的積累和提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性來增強(qiáng)植物對病原菌的抗病性[24]。脂肪酸是植物表面蠟、角質(zhì)及木栓質(zhì)的重要組成部分，這些結(jié)構(gòu)可以改變組織厚度和滲透性以保護(hù)植物免受環(huán)境脅迫和微生物的侵襲[25]，已有研究表明[26]細(xì)胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)會裝載特定的miRNA，為miRNA的長距離跨物種轉(zhuǎn)移途徑提供了有利證據(jù)，這些EVs是否通過胞吞作用進(jìn)入另一生物細(xì)胞內(nèi)尚不得而知，但本試驗(yàn)結(jié)果為這一猜想提供了一定可能。以上證據(jù)表明這些差異表達(dá)miRNA在甜瓜抵御列當(dāng)入侵中發(fā)揮重要作用。

橫坐標(biāo)代表差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與整個(gè)差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG注釋通路，圓點(diǎn)大小代表該通路基因數(shù)量，p-value ≤ 0.1。圖6 差異miRNA靶基因KEGG功能注釋圖

2.4 轉(zhuǎn)移miRNA篩選結(jié)果

通過對轉(zhuǎn)移miRNA的篩選，共鑒定到3個(gè)從甜瓜轉(zhuǎn)移至列當(dāng)?shù)囊阎猰iRNA和3個(gè)從列當(dāng)轉(zhuǎn)移至甜瓜新的miRNA(表3)。其中3個(gè)已知miRNA分別為cme-miR162、cme-miR398a和cme-miR169r，這些miRNA主要涉及DCL酶剪切體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和胞吞作用；3個(gè)新的miRNA分別為novel_2、novel_56和novel_8，其功能主要涉及甾醇生物合成、pre-mRNA剪切蛋白和LRR絲氨酸/蘇氨酸受體樣激酶的合成，LRR絲氨酸/蘇氨酸受體樣激酶可以將胞外信號傳入胞內(nèi)從而影響基因轉(zhuǎn)錄[27]。從這些轉(zhuǎn)移miRNA的功能推測，由甜瓜轉(zhuǎn)移至瓜列當(dāng)?shù)膍iRNA可能通過影響列當(dāng)?shù)膍iRNA的生物合成來抑制列當(dāng)?shù)纳L，而瓜列當(dāng)轉(zhuǎn)移至甜瓜的miRNA則可能通過本身毒力因子和阻止甜瓜mRNA的合成來抑制甜瓜防御相關(guān)基因的表達(dá)。

2.5 差異基因及轉(zhuǎn)移miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取了13個(gè)差異基因及轉(zhuǎn)移miRNA對其相對表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示所選取基因的qRT-PCR結(jié)果與sRNA測序含量盡管存在差異，但其在各樣品中的表達(dá)趨勢具有一致性(圖7)，說明sRNA測序結(jié)果可靠，轉(zhuǎn)移miRNA的篩選結(jié)果可信。

表3 轉(zhuǎn)移miRNA及靶基因注釋信息

圖7 差異轉(zhuǎn)移miRNA(A)及差異miRNA(B)相對表達(dá)量qRT-PCR驗(yàn)證

3 討論

已有大量文獻(xiàn)證實(shí)寄主和寄生物之間存在復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)移，這些物質(zhì)在轉(zhuǎn)移后會對雙方產(chǎn)生重要影響。Jiang等[28]研究表明菟絲子通過從過表達(dá)磷脂酶乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因的轉(zhuǎn)基因宿主獲得對草甘膦的瞬時(shí)抗性，而大豆蚜蟲(Aphisglycines)取食寄生大豆的菟絲子后誘導(dǎo)了寄主大豆的系統(tǒng)防御反應(yīng)，從而增強(qiáng)了大豆植株對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和大豆蚜蟲的抗性[29]。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)N系統(tǒng)信號可以通過菟絲子在缺N植株和N充足植株間雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致N充足植株對N的吸收增加，這些N系統(tǒng)信號還誘導(dǎo)了菟絲子和寄主之間許多遠(yuǎn)距離移動的mRNA轉(zhuǎn)移。列當(dāng)作為寄生在寄主根部的全寄生性植物，同樣存在著大量轉(zhuǎn)移物質(zhì)，Kado等[31]研究檢測了列當(dāng)科的五種寄生植物，在Orobancheminor和Aeginetiaindica中共檢測到了106個(gè)水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)，HGT基因分別約占編碼基因的0.1%和0.2%。Aly[5]發(fā)現(xiàn)當(dāng)表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因番茄植株被瓜列當(dāng)寄生時(shí)，大量的GFP從寄主韌皮部轉(zhuǎn)移到列當(dāng)韌皮部，并在列當(dāng)根瘤和莖稈中積累。另外黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和黃曲葉病毒(TYLCV)也被證明可從受侵染的寄主植物轉(zhuǎn)移到瓜列當(dāng)上[32]。這些證據(jù)表明在寄生植物和寄主間雙向交流的大分子物質(zhì)在其寄生體系中具有重要作用，但目前對列當(dāng)與寄主間其他物質(zhì)轉(zhuǎn)移仍有待研究。

miRNA可以通過宿主轉(zhuǎn)移至寄生性生物體內(nèi)，通過RNA干擾(RNAi)提高寄主對寄生生物的抗性[16]。Shahid等[6]研究表明菟絲子在寄生擬南芥和本氏煙時(shí)積累了大量新的miRNA，這些miRNAs作為寄主基因表達(dá)的跨物種調(diào)節(jié)因子，在寄生過程中可能發(fā)揮毒力因子的作用。但瓜列當(dāng)在寄生甜瓜的過程中是否以miRNA復(fù)合體進(jìn)行長距離移動尚有待研究[33]。本研究結(jié)果顯示sRNA測序在列當(dāng)與甜瓜根部寄生界面(MC)中顯著富集為22 nt長度的miRNA，這與Shahid的研究結(jié)果相似[6]。篩選到的轉(zhuǎn)移miRNA之一miR162在被寄生甜瓜根中顯著上調(diào)表達(dá)并由甜瓜轉(zhuǎn)移至列當(dāng)體內(nèi)，而miR162的過表達(dá)可以抑制DCL1的表達(dá)[34]，Dicer-like(DCL)酶是miRNA生物合成的必備物質(zhì)[35]，能夠參與發(fā)育調(diào)節(jié)[36]、表觀遺傳修飾[37]、以及在生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[38，39]。而DCL1的沉默不僅導(dǎo)致水稻苗期生長發(fā)育停滯，而且還能夠誘導(dǎo)防御免疫反應(yīng)，包括H2O2的積累和細(xì)胞的死亡從而抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的擴(kuò)展，增強(qiáng)水稻對稻瘟病的抗性[40]。因此推測甜瓜可能通過miR162的過表達(dá)以啟動自身防御免疫的應(yīng)答，并轉(zhuǎn)移至列當(dāng)，負(fù)調(diào)控列當(dāng)miRNA的產(chǎn)生，從而影響列當(dāng)?shù)纳L發(fā)育和寄生過程。而miR398a主要參與活性氧清除酶Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的負(fù)調(diào)控，寄生體毒性與致病力越強(qiáng)，miR398a上調(diào)幅度越大，最終導(dǎo)致被寄生處宿主的細(xì)胞因ROS過多而死亡[41]。甜瓜在被列當(dāng)寄生后導(dǎo)致根部miR398a的顯著表達(dá)，表明miR398a可能通過抑制寄生根部細(xì)胞ROS酶的活性，增加了寄生部位細(xì)胞ROS含量，最終導(dǎo)致被寄生細(xì)胞因死亡限制列當(dāng)?shù)募纳琺iR398a的轉(zhuǎn)移也可能能夠通過使列當(dāng)細(xì)胞的壞死來限制列當(dāng)?shù)纳L。

從瓜列當(dāng)轉(zhuǎn)移至甜瓜的novel_2主要靶向STABILIZED1蛋白，該蛋白是pre-mRNA的剪切和mRNA轉(zhuǎn)錄所必需的[42]，novel_56則與鈣離子合成蛋白PICBP有關(guān)，鈣離子合成蛋白在Ca2+信號傳導(dǎo)系統(tǒng)傳導(dǎo)中具有重要作用，可以調(diào)控生理代謝及基因表達(dá)，控制細(xì)胞正常的生長和發(fā)育[43]。因此，瓜列當(dāng)可能通過轉(zhuǎn)移miRNA調(diào)控甜瓜mRNA的合成與轉(zhuǎn)錄及抑制防御相關(guān)信號的傳導(dǎo)促進(jìn)自身生長。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明瓜列當(dāng)在寄生甜瓜的過程中確實(shí)存在miRNA轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，且這一現(xiàn)象并不單一存在于寄主或寄生物一方，而是相互均有轉(zhuǎn)移，共篩選到3個(gè)已知甜瓜miRNA轉(zhuǎn)移至瓜列當(dāng)(cme-miR162、cme-miR398a、cme-miR169r)，3個(gè)新瓜列當(dāng)miRNA轉(zhuǎn)移至甜瓜(novel_2、novel_56、novel_8)，甜瓜作為寄主可能通過miRNA的轉(zhuǎn)移來抑制或限制列當(dāng)?shù)募纳?，列?dāng)作為全寄生植物也可能會利用miRNA的轉(zhuǎn)移來抑制寄主防御反應(yīng)的信號應(yīng)答。本試驗(yàn)從miRNA轉(zhuǎn)移的角度，為進(jìn)一步揭示瓜列當(dāng)寄生甜瓜的分子機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)。