王子琰 王建 張倫 桂水清 盧雪梅

（1. 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2. 深圳市第二人民醫(yī)院 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心ICU，深圳 518031）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），是生物免疫系統(tǒng)對抗多種病原微生物感染所產(chǎn)生的一類小分子多肽，一般具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性高、抗菌譜廣、免疫原性低等特性，具有高效性和安全性［1-3］；并且因其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)活性等一系列引人注目的生物學(xué)活性，而受到醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注［4-7］。昆蟲是抗菌肽研究開發(fā)的重要資源，昆蟲血淋巴中能迅速大量地合成昆蟲抗菌肽來抵御外界微生物的刺激，維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［8-9］。昆蟲抗菌肽Cecropin是人類最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)α-螺旋狀抗菌肽，其通過注射陰溝腸桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹而被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)［10］?？咕腃ecropin能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜或穿過細(xì)胞膜作用于胞內(nèi)靶位點(diǎn)，因其特殊的耐藥機(jī)制不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，且與其他的抗菌藥物不易產(chǎn)生交叉耐藥性［11-13］。這一系列特點(diǎn)及廣泛的生物學(xué)活性，顯示出昆蟲抗菌肽Cecropin在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

沙門氏菌（Salmonella）是一種革蘭氏陰性菌，是最常見的人畜共患腸道致病菌之一，主要通過污染的食物或水經(jīng)糞口傳播［14-15］。其中，鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）廣泛分布于自然界，是最常見的血清型之一，它對生存環(huán)境的要求較低，甚至植物也可以作為它的宿主［16］。感染鼠傷寒沙門氏菌輕則可以導(dǎo)致腸炎，重則可以引起敗血癥和全身系統(tǒng)性臟器損傷，幼兒、老人以及免疫力低下者都較易導(dǎo)致重癥［17］。

家蠅抗菌肽（Musca domestica cecropin，MDC）是本實(shí)驗(yàn)室從家蠅幼蟲脂肪體cDNA文庫中克隆獲得的一種昆蟲抗菌肽。在前期實(shí)驗(yàn)研究中，證實(shí)抗菌肽MDC對多種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都有抑菌作用，其中包括鼠傷寒沙門氏菌［18-19］，與此同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽MDC和頭孢曲松鈉能協(xié)同抑制鼠傷寒沙門氏菌和初始生物膜，破壞成熟生物膜［20］。

為了探討家蠅抗菌肽MDC的使用方法及成藥價(jià)值，本文研究了其在不同外界條件下對鼠傷寒沙門氏菌抑菌性的影響情況，以期為家蠅抗菌肽MDC治療鼠傷寒沙門氏菌的感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌肽 家蠅抗菌肽MDC是本實(shí)驗(yàn)室從家蠅幼蟲脂肪體cDNA文庫中克隆的一種昆蟲抗菌肽，氨基酸序列為：GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQTIG VAQQAANVAATLKG?？咕腗DC由北京中科亞光生物科技有限公司合成，純度97.15%，分子質(zhì)量為4 301.59 Da，附純度液相分析圖及質(zhì)譜圖（圖1-2）。

圖1 MDC的HLPC色譜圖Fig.1 HLPC of MDC

1.1.2 菌株 鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium（S.typhimurium）CMCC50115購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 主要試劑 LB瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；氫氧化鈉、氯化鈣（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸、甲醇、異戊醇、甲醛（廣州化學(xué)試劑廠）；胰蛋白酶（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；胃蛋白酶、吐溫20（上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鉀、氯化鐵、吐溫80（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化鎂（上海源葉生物科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉SDS（廣州瑞舒生物科技有限公司）；無水乙醇、異丙醇、丙三醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 方法

圖2 MDC的質(zhì)譜圖Fig.2 MS analysis of MDC

1.2.1 不同pH對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 用滅菌的雙蒸水稀釋鹽酸原液和無菌氫氧化鈉溶液，調(diào)整pH為1、3、5、7、9、11和13作為貯備液，備用。將制備好的不同pH貯備液分別溶解MDC粉末，室溫放置1 h后，再用濃度為0.1 mol/L的無菌NaOH或HCl調(diào)節(jié)其終濃度為1 mg/mL，且pH在6.0-8.0之間，以排除過酸、過堿對微生物生長的抑制。取出菌液，放至室溫后，在無菌操作臺(tái)中，用移液槍吸取100 μL置于100 mL固體LB培養(yǎng)基中（液體狀態(tài)，60℃），搖勻倒板，待其完全冷卻凝固后，用無菌鑷子取牛津杯貼在平板表面，加入100 μL待測樣品，最后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)10 h后，取出，移除牛津杯，測量抑菌圈直徑，做好記錄統(tǒng)計(jì)，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存。以生理鹽水為陰性對照，加入30 μL濃度為4 μg/mL的頭孢曲松鈉作為陽性對照，加入100 μL未經(jīng)任何處理的濃度為1 mg/mL的MDC作為正常對照。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 不同溫度對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 將MDC 在溫度梯度為：-80℃（長期）、-20℃（長期）、4℃（24 h）、37℃（24 h）、70℃（2 h）、100℃（10 min）下處理后，分別配成濃度為1 mg/mL的溶液，然后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（待測樣品體積為100 μL），測量抑菌圈直徑，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存，具體步驟同1.2.1中一致。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 不同光照對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 將MDC在避光、紫外線（33 W/cm2）和正常光（300 lx）下照射30 min，分別配成濃度為1 mg/mL的溶液，然后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（待測樣品體積為100 μL），測量抑菌圈直徑，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存，其余具體步驟同1.2.1中一致。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白酶對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 取500 μL濃度為2 mg/mL的MDC與等體積的1 mg/mL的胰蛋白酶/胃蛋白酶混合，在37℃孵育10 min，95℃滅活處理5 min。另外將MDC正常對照組用不經(jīng)蛋白酶處理但將MDC經(jīng)95℃處理5 min代替，然后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（待測樣品體積為100 μL），測量抑菌圈直徑，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存，其余具體步驟同1.2.1中一致。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 金屬離子對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 分別用1 mL配制好的濃度為0.3 mol/L的氯化鈣、氯化鉀、氯化鐵、氯化鎂溶液溶解MDC，其終濃度為1 mg/mL，放置1 h后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（待測樣品體積為100 μL），測量抑菌圈直徑，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存，其余具體步驟同1.2.1中一致。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 表面活性劑對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 用1 mL的10%的吐溫20、吐溫80以及20%SDS去溶解MDC，其終濃度為1 mg/mL，放置1 h后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（待測樣品體積為100 μL），測量抑菌圈直徑，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存，其余具體步驟同1.2.1中一致。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 有機(jī)試劑對抗菌肽MDC抑菌活性的影響 用1 mL的20%甲醇、乙醇、異戊醇、丙三醇及異丙醇去溶解MDC，其終濃度為1 mg/mL，放置1 h后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（待測樣品體積為100 μL），測量抑菌圈直徑，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像保存，其余具體步驟同1.2.1中一致。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)收集數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，運(yùn)用ANOVA和LSD法進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同pH對MDC抑菌活性影響

以鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50115）為指示菌，研究不同pH對抗菌肽MDC抑菌效果。不同pH處理MDC后，其抑菌活性變化如圖3所示：可看出pH值為1、3、5時(shí)，其抑菌活性分別下降了13.7%、13.1%和13.1%，隨著pH增大，抑菌活性無明顯改變。說明酸性條件下，MDC的活性結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，而其在堿性條件下，穩(wěn)定性較好。

圖3 MDC經(jīng)不同pH處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium after different pH treatment

2.2 不同溫度對MDC抑菌活性影響

MDC經(jīng)過不同溫度處理后，其抑菌活性變化如圖4所示，MDC在-80℃和-20℃長期保存，其持續(xù)保持良好的抑菌活性。MDC在4℃和37℃條件下存放24 h，其活性無明顯改變。隨著溫度進(jìn)一步升高，MDC在70℃時(shí)放置2 h，在100℃加熱10 min，與低溫保存相比，其抑菌活性仍然無顯著差異。上述結(jié)果說明MDC無論在低溫還是高溫條件下都具有極好的穩(wěn)定性。

圖4 MDC經(jīng)不同溫度處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium after different temperature treatment

2.3 不同光照條件對MDC抑菌活性影響

由圖5可以看出，MDC在避光條件下處理與正常光照以及紫外光線照射處理相比，其對鼠傷寒沙門氏菌的抑制活性無明顯差異，都能達(dá)到相應(yīng)的抑制效果，說明MDC在不同光照條件下，均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

圖5 MDC經(jīng)不同光照條件處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium under different light condition

2.4 蛋白酶對MDC抑菌活性影響

圖6結(jié)果表明，MDC經(jīng)過胰蛋白酶處理后，其抑菌活性完全消失，說明其活性結(jié)構(gòu)徹底被破壞，因此，在胰蛋白酶存在下，MDC不穩(wěn)定。相比之下，MDC活性結(jié)構(gòu)幾乎不被胃蛋白酶破壞，能夠很好地發(fā)揮抗鼠傷寒沙門氏菌效果，極其穩(wěn)定。

圖6 MDC經(jīng)不同蛋白酶處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium after different proteases treatment

2.5 金屬離子對MDC抑菌活性影響

如圖7顯示，0.3 mol/L的鈣離子和鉀離子溶液處理MDC不會(huì)造成其抑菌活性降低，說明在這兩種離子存在的條件下，MDC比較穩(wěn)定。用0.3 mol/L鐵離子處理MDC不僅不會(huì)造成其活性的降低，同時(shí)會(huì)協(xié)同MDC增強(qiáng)抑制鼠傷寒沙門氏菌效果，其抑菌活性增加了59.6%。相比之下，0.3 mol/L鎂離子會(huì)造成MDC抑菌活性降低了31.1%，說明鎂離子一定程度上破壞了MDC活性結(jié)構(gòu)，因此，MDC在鎂離子存在條件下，穩(wěn)定性會(huì)有所降低。

圖7 MDC經(jīng)不同金屬離子處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium after different metal ion treatment

2.6 表面活性劑對MDC抑菌活性影響

由圖8可看出，10%的吐溫20和吐溫80以及20% SDS均能顯著的降低MDC抑菌活性，分別降低了40.5%、47.3%和43.2%，表明MDC在這3種表面活性劑存在時(shí)，其活性結(jié)構(gòu)會(huì)遭到一定程度上的破壞，穩(wěn)定性較差。

圖8 MDC經(jīng)不同表面活性劑處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.8 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium after different surfactant treatment

2.7 有機(jī)溶劑對MDC抑菌活性影響

如圖9所示，20%甲醇、乙醇、異戊醇、丙三醇及異丙醇均能顯著的降低MDC抑菌活性，分別降低了39.2%、39.9%、30.8%、31.5%和38.5%。表明這幾種有機(jī)試劑能夠在一定程度上破壞MDC活性結(jié)構(gòu)，當(dāng)這幾種有機(jī)試劑存在時(shí)，其穩(wěn)定性很差，但仍然有一定的抑菌活性。

圖9 MDC經(jīng)不同有機(jī)試劑處理后對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性Fig.9 Antibacterial activity of MDC on S. typhimurium after different organic solvent treatment

3 討論

抗生素最初對鼠傷寒沙門氏菌具有較好的抑菌效果，但在臨床應(yīng)用中為取得更好的效果，不僅加大抗生素的用量，還會(huì)使用抗菌效果更好的抗生素，伴隨著抗生素的濫用，對抗生素產(chǎn)生耐藥性的菌株越來越多，再次使用抗生素治療時(shí)，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性［21-22］?？咕呐c抗生素不同的作用機(jī)制使其不易產(chǎn)生耐藥性菌株［23］，前期研究發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽MDC對鼠傷寒沙門氏菌具有較好的抗菌活性，并且可以與頭孢曲松鈉產(chǎn)生協(xié)同作用，這不僅降低了耐藥性的發(fā)生率，同時(shí)還增強(qiáng)了抗菌效果，這為治療鼠傷寒沙門氏菌的感染提供一種新的策略［20］。

抗菌肽的應(yīng)用會(huì)受到強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及溫度等多種不穩(wěn)定因素的影響［24］。例如，山羊乳酪蛋白抗菌肽在酸性條件會(huì)使得其抑菌效果明顯減弱，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗菌肽pH調(diào)到3時(shí)，抗菌肽出現(xiàn)嚴(yán)重絮凝現(xiàn)象［25］；小麥蛋白抗菌肽在酸性條件下隨著pH的升高，抑菌率呈上升趨勢，在接近中性pH時(shí)，抗菌肽抑菌活性變化不大，但在堿性條件下，樣品的抑菌活性又隨pH升高而降低［26］；海南沼蛙皮膚抗菌肽temprin-GHb經(jīng)80℃處理20 min后抑菌圈直徑從9 mm降至5 mm［27］。本研究發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽MDC的抑菌活性經(jīng)不同pH、溫度、光照、胃蛋白酶和金屬離子穩(wěn)定性處理后，與對照組比較無顯著差異，且Fe3+能夠協(xié)同增強(qiáng)MDC的抑菌活性，說明抗菌肽MDC具備較強(qiáng)的抗變性能力，穩(wěn)定性較好；該結(jié)果與蘿卜籽抗菌肽［28］及芽孢桿菌抗菌肽［29］的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這可能與抗菌肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)，酶切位點(diǎn)沒有影響到抗菌肽的功能片段。

通過分析抗菌肽在多種理化因素作用下的抑菌活性，可為抗菌肽的使用方式和成藥價(jià)值提供參考。本研究發(fā)現(xiàn)不同pH處理后，抗菌肽MDC的抑菌活性基本無影響，在pH值為1、3、5時(shí)，其抑菌活性稍有降低，隨著pH增大，抑菌活性無明顯改變，而其在堿性條件下，穩(wěn)定性較好。這些結(jié)果決定了其更適用于中性及堿性條件下的應(yīng)用，可以彌補(bǔ)其他堿性條件活性衰減的抗菌肽在應(yīng)用中的不足。結(jié)合本研究結(jié)果，可認(rèn)為抗菌肽MDC在動(dòng)物腸道的pH條件下具有較好的抑菌活性，但若通過口服到達(dá)胃部，其抑菌活性會(huì)受到胃液高酸度的影響。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶不會(huì)影響其抑菌活性，但胰蛋白酶會(huì)顯著影響其抑菌活性，表明抗菌肽MDC的序列中存在胰酶的剪切位點(diǎn)。因此，若將抗菌肽MDC通過口服給藥，應(yīng)采取一定保護(hù)措施以通過胃和小腸，到大腸后釋放以發(fā)揮相應(yīng)作用。

4 結(jié)論

家蠅抗菌肽MDC能顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌生長繁殖，pH值、溫度、光照、胃蛋白酶和金屬離子并不會(huì)影響MDC的抑菌活性。然而，胰蛋白酶、Mg2+、表面活性劑和有機(jī)試劑對其抑菌活性產(chǎn)生一定的抑制作用。此外，F(xiàn)e3+能夠協(xié)同增強(qiáng)MDC的抑菌活性。家蠅抗菌肽MDC具備開發(fā)為新型抗鼠傷寒沙門氏菌藥物的潛力，可作為新型抗菌藥物進(jìn)一步深入研究。