王劍虹，賈國軍，王春霖，張 娜

(蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系， 甘肅 蘭州 730070)

一、富硒蛹蟲草

蛹蟲草亦稱蛹草、北蟲草或北冬蟲夏草。野生蛹蟲草菌株寄主范圍廣泛，故分布也十分廣泛，在分類學(xué)中屬于子囊菌門，子囊菌綱，蟲草屬[1]，為名貴中藥材。它富含蛹蟲草菌素3’—腺嘌呤苷和5’—三磷酸鹽蟲草菌素，可以治療結(jié)核、體虛、貧血等疾病[2]。同時富含蟲草多糖、生物堿等多種生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫功能，調(diào)節(jié)心、肝、腎及呼吸系統(tǒng)的功能；提高細(xì)胞能量、有抗疲勞、直接抗腫瘤作用，改善胰島素分泌等多種藥理作用[3]。

硒具有抗氧化、調(diào)節(jié)體內(nèi)維生素代謝、保護(hù)細(xì)胞膜和增強免疫力的重要作用，被稱為人體微量元素的“抗癌之王”。擁有抗腫瘤、抗HIV病毒，改善男性生殖功能等作用[4-9]，與自身免疫性甲狀腺疾病、敗血癥、腦血管病、關(guān)節(jié)炎、肝病等多種疾病密切相關(guān)。當(dāng)人體硒攝入不足導(dǎo)致輕度、中度缺硒時，身體癥狀不明顯，嚴(yán)重時可導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病、高血壓、糖尿病甚至癌癥等疾病。

19世紀(jì)補鐵，20世紀(jì)補鋅，21世紀(jì)則是硒的世紀(jì)。中國營養(yǎng)學(xué)會推薦正常成年人每天硒的攝入量為50-250 μg，長期低于50 μg就會發(fā)生硒缺乏癥。據(jù)統(tǒng)計，世界上有42個國家和地區(qū)存在硒缺乏癥，中國處于全球缺硒區(qū)，全國近72%的地區(qū)在一定程度上缺硒[10]。中國的居民很容易缺硒?；加腥蔽Y的人群通過適量補硒后，既能預(yù)防腫瘤、肝臟、關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生，還可以維持大腦、心、肝、肺、胃的正常功能，從而預(yù)防老年腦血管病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，相比無機硒而言，有機硒由于其安全性高，更容易被人體吸收和利用而被人們廣泛接受[11]。因此，利用生物學(xué)原理，運用生物轉(zhuǎn)化等方法獲得低毒、高效、安全的有機硒是當(dāng)前的研究熱點之一。

富硒食品有兩種，一種是天然就含有硒元素的富硒食品，被稱為活性硒食品。另一種是通過各種方法添加外源硒使其富硒的食品，例如富硒大米、富硒花生、富硒食鹽等。真菌可以吸收礦質(zhì)元素，通過生物轉(zhuǎn)化作用，能夠?qū)⑽盏阶訉嶓w中的無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒。研究結(jié)果表明，與普通食用菌相比，富硒食用菌具有更高的生物活性和藥用價值。作為富硒載體，只要食用菌子實體內(nèi)硒濃度在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，食用富硒食用菌對人體沒有毒副作用，同時適當(dāng)濃度的硒可以促進(jìn)食用菌的生長，提高食用菌的產(chǎn)量、品質(zhì)和營養(yǎng)[11]。目前，已培養(yǎng)出了富含硒的靈芝、金針菇和平菇[13-16]。蛹蟲草是硒的優(yōu)良載體，富硒蛹蟲草子實體中硒主要以SeCys2和SeMet2兩種形態(tài)存在[17],是有機硒化程度較高的富硒載體。富硒蛹蟲草主要的功效和作用體現(xiàn)在“硒”和“蟲草素”兩個物質(zhì)成分中[18]，這兩種主要成分讓富硒蛹蟲草發(fā)揮其效果，在培育過程中可定向提高其含量，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、安全、高效的富硒蛹蟲草。

二、富硒蛹蟲草菌株

蛹蟲草不同菌株對硒的耐受性不同，需要通過循環(huán)富硒法提高菌株的耐受性[19]。生產(chǎn)中應(yīng)選擇菌絲濃密、粗壯、潔白、見光后轉(zhuǎn)色快、出草整齊、生長期短、產(chǎn)量高、硒耐受性強的菌株做為栽培種。

三、栽培要點

(一)菌種制備

1.菌種活化

取保藏的蛹蟲草菌種Fx-C5接種于加富PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。PDA加富培養(yǎng)基配方：馬鈴薯100 g、C6H12O615 g、淀粉5 g、蔗糖10 g、蛋白胨5 g、酵母膏3 g、KH2PO41 g、K2HPO41 g、MgSO41 g、水1000 mL，pH自然。配置好后，放入高壓鍋，在121℃下，滅菌30 min。然后分裝、滅菌、制斜面，按常規(guī)進(jìn)行。將菌種Fx-C5接到試管培養(yǎng)基上(見圖1)，放置于培養(yǎng)箱中20℃下，避光培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面后，接種于液體培養(yǎng)基。

2.液體菌種制備

培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO41 g/L，維生素B150 mg/L，配制液體種培養(yǎng)基。將配制好的液體培養(yǎng)基倒入500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，121℃高壓滅菌20 min。待其冷卻后，在超凈工作臺內(nèi)，按無菌操作要求，挑取少許帶有培養(yǎng)基的活化菌種1-2小塊接種至液體培養(yǎng)基中，置于20-22℃環(huán)境中避光靜置培養(yǎng)1-2天，再移至搖床上震蕩培養(yǎng)，溫度控制在20℃，轉(zhuǎn)速150 r，培養(yǎng)6-10天。當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液逐漸澄清，里面有大量直徑約2毫米的菌絲球均勻分布，顏色呈深棕色，有濃郁香味時，說明液體菌種已經(jīng)培養(yǎng)好了(見圖2)。制備好的液體菌種在使用前需用無菌水稀釋。液體菌種：無菌水等于1:4。同時制備好的液體菌種不能放置時間過長，最好在48小時內(nèi)使用。

圖1 活化菌種 圖2 液體菌種

(二)富硒原料選擇及培養(yǎng)液制備

選擇富硒區(qū)域生產(chǎn)的大米或小麥做為栽培原料，要求新鮮、無霉變，無蟲害。營養(yǎng)液配方：葡萄糖20 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L、檸檬酸三銨1 g/L、維生素B150 mg/L，亞硒酸鈉0-20 mg/L(依據(jù)對子實體含硒要求，適宜添加)，水1000 ml，PH自然。

(三)栽培管理

人工栽培蛹蟲草的方式主要有兩種，一種是蟲體栽培模式，即利用蟲體做培養(yǎng)基；一種是代料栽培模式，即根據(jù)蛹蟲草生長過程中對各種營養(yǎng)物質(zhì)的需求，人工配制培養(yǎng)基。代料栽培模式又分為瓶栽、盆栽和袋栽。瓶栽法要點如下。

1.栽培料及組成

可以用富硒大米、富硒小麥等作為栽培料主料。在大規(guī)模生產(chǎn)時，每個栽培瓶(罐頭瓶，規(guī)格750 mL或500 mL)中可裝固體料35-25克，再加營養(yǎng)液50-40 mL。配方見表1。

2.滅菌

在培養(yǎng)瓶中依據(jù)表1加入主料和營養(yǎng)液，選用0.05 mm厚的聚丙烯塑料薄膜扎緊瓶口，放入高壓鍋進(jìn)行滅菌，當(dāng)鍋內(nèi)溫度升至95-99℃時，需要排氣1 min左右，以便排空鍋內(nèi)冷空氣，使滅菌徹底。關(guān)閉排氣閥，使鍋內(nèi)溫度升至121℃滅菌30 min。常壓滅菌，需保持在100℃，8小時。滅菌后，培養(yǎng)瓶內(nèi)的飯粒之間要有空隙，利于菌絲呼吸，飯粒不生也不成糊狀。

滅菌時要將稀釋液體菌種的水，一并滅菌，即得無菌水。用無菌水稀釋制備好的液體菌種。

表1 瓶裝栽培主料規(guī)格和構(gòu)成成分表

3.接種

滅菌結(jié)束，須等待培養(yǎng)瓶冷卻后再接種。按照無菌操作要求，在無菌操作臺上，用接種槍(滅菌處理后)取稀釋好的液體菌種8-10 mL進(jìn)行接種。蛹蟲草菌種抗逆性差，接種時一定要在無菌操作臺上進(jìn)行，以免雜菌感染培養(yǎng)基。

4.發(fā)菌管理

接種后，室內(nèi)溫度要稍低一些，可以減少蛹蟲草菌絲生長初期的雜菌污染，一般調(diào)至15-18℃，培養(yǎng)1-2天后，菌絲萌發(fā)，定植再上架培養(yǎng)(圖3)。為了防止菌液、營養(yǎng)液和培養(yǎng)基倒向一側(cè)，導(dǎo)致蛹蟲草出草不整齊，栽培瓶需要直立放置。當(dāng)菌絲長滿培養(yǎng)基表面后，菌絲體進(jìn)入生長后期，這時溫度以18-24℃為宜；環(huán)境濕度在65%-70%為宜；可根據(jù)培養(yǎng)室所放菌瓶數(shù)確定通風(fēng)次數(shù)及通風(fēng)量，以保證培養(yǎng)室內(nèi)空氣清新適度(圖4)。蛹蟲草的菌絲生長階段需要避光處理，當(dāng)培養(yǎng)料中長滿白色菌絲后，給予光線刺激，使菌絲進(jìn)入生殖生長階段，過早見光會影響蛹蟲草的產(chǎn)量和品質(zhì)。

圖3 上架培養(yǎng) 圖4 菌絲體

5.子實體管理

菌絲成熟后(培養(yǎng)基被白色菌絲布滿)，將溫度控制在15-20℃，菌絲體的顏色由淺到深逐漸變化(白色變?yōu)殚冱S色)，同時晝夜溫差應(yīng)增大，增加光照時間和光照強度，白天利用自然光線，光照強度應(yīng)保持在150-200 lx，照明時間每天不少于10小時，若光照時間不夠，夜晚可以用日光燈作為補充光源。此條件下可以刺激原基的形成和菌絲體轉(zhuǎn)色完成。當(dāng)栽培瓶中有黃色水珠聚集，培養(yǎng)基表面或周圍出現(xiàn)橘黃色色素，菌絲體生長呈大小不同的圓丘狀，顏色為橘黃色，此即為子座的前體(圖5)。這時要調(diào)整室內(nèi)光照、溫度和濕度，停止人工光照，光照強度增加至300-500 lx，溫度保持在18-23℃，加大晝夜溫差；相對濕度提高到85%-90%，濕度過高會導(dǎo)致栽培瓶內(nèi)營養(yǎng)生長(氣生菌絲的生長)過于旺盛，不利于子實體的生長；濕度過低，培養(yǎng)基會失水過多而干燥，影響菌絲體及子實體的生長發(fā)育。蛹蟲草具有向光生長的特性，為了讓子實體直立生長，不向一側(cè)彎曲，可以調(diào)整培養(yǎng)瓶與光源相對方向，也可以調(diào)整室內(nèi)光源的方向，從而保證子實體的正常生長，促進(jìn)其產(chǎn)量的提高和品質(zhì)提升。在子實體生長期間，應(yīng)加大通風(fēng)量，提供新鮮空氣，保證瓶內(nèi)外氣體交換。

6.采收

經(jīng)過15天左右，子座(圖6)長出表面高度2-8厘米，直徑2-5毫米，呈黃色或紅棕色，當(dāng)子座上半部的可孕部表面可見半埋生的子囊殼時，用鑷子夾出或用剪刀將紙做基部剪斷，注意不要等到子囊孢子彈射，否則功效減退。

子實體采收后先整理其根部，使其保持干凈整潔，然后曬干或低溫烘干，用防潮包裝保藏。蛹蟲草子實體干品含水量應(yīng)在13%以下。

圖5 子座前體 圖6 成熟子座

四、結(jié)語

優(yōu)質(zhì)富硒蛹蟲草子實體，有機硒最高含量在300-500微克/公斤左右。富硒蛹蟲草中的有機硒極利于人體吸收，在治失眠、體困無力、感冒、心腦血管疾病、氣管炎、肝癌、肺癌、胃癌、白血病等多種疑難病方面，均有較好的輔助作用。培育富硒蛹蟲草，進(jìn)一步加強了蛹蟲草的藥用和保健效果，提升了蛹蟲草的生物附加值，同時為蟲草屬生物資源的進(jìn)一步開發(fā)、利用提供了有益參考。