李 菲，蘇芯瑩，李 喆，王巧貞，黃庶識(shí)，楊慧歡，覃仙玲**

(1.廣西科學(xué)院，廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；2.廣西科學(xué)院，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；3.南寧學(xué)院機(jī)電與質(zhì)量技術(shù)工程學(xué)院，廣西南寧 530200)

海洋是地球上最大的水生生態(tài)系統(tǒng)，約占地球總表面積的71%。海洋中海流、波浪、潮汐和風(fēng)暴潮等海水運(yùn)動(dòng)，可引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大規(guī)模的水平/垂直運(yùn)輸[1,2]。在洋流的驅(qū)動(dòng)下，體積小、擴(kuò)散能力強(qiáng)的微生物遍布海洋的每個(gè)角落，承擔(dān)著海洋生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)[3,4]。莊康等[5]指出，與陸地微生物相比，海洋微生物在物種類(lèi)群、生理代謝通路及代謝產(chǎn)物等方面都更具新穎性和多樣性。故利用可培養(yǎng)方法來(lái)獲得海洋微生物資源，開(kāi)展其生理生化特征與生態(tài)功能研究，對(duì)物種庫(kù)與功能基因庫(kù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用有著重要的意義。目前，關(guān)于廣西北部灣海域中可培養(yǎng)微生物的研究大多集中在海洋沉積物、海洋動(dòng)植物及紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)[6,7]，對(duì)海水中可培養(yǎng)微生物的研究鮮有報(bào)道，究其原因可能是海水中微生物的豐度、潛在新物種數(shù)量及其代謝功能均較海洋其他來(lái)源的微生物低，未獲得廣泛關(guān)注。本研究選取的3處近岸港灣分別為廣西北部灣茅尾海(002站位)、珍珠港(073站位)和北侖河口(067站位)。3處港灣的紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)生物群落豐富，加上大量的生蠔養(yǎng)殖，豐富了海水中的組成成分，加快了能量和物質(zhì)循環(huán)速度，增強(qiáng)了微生物的生產(chǎn)力和有機(jī)質(zhì)的代謝能力。此外，067站位位于敞開(kāi)式海域，002站位和073站位屬于半封閉內(nèi)海，使得3處海域中海水的硅酸鹽、銨鹽及鹽度等理化指標(biāo)上存在較大差異。

本課題組致力于海洋沉積物、海洋動(dòng)植物及紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)中可培養(yǎng)微生物的分離鑒定及功能菌株的挖掘[8-11]，深知開(kāi)展微生物次級(jí)代謝活性物質(zhì)的分離、純化、組成和結(jié)構(gòu)解析等工作需要花費(fèi)大量的精力、時(shí)間和費(fèi)用，且往往會(huì)遇到次級(jí)代謝產(chǎn)物率低、重現(xiàn)性差和反復(fù)挖掘等問(wèn)題[12]。此外，從微生物中分離到的化合物種類(lèi)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其基因組中次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的數(shù)目，即有為數(shù)不少的基因簇在實(shí)驗(yàn)室條件下表達(dá)量低或不表達(dá)，難以在傳統(tǒng)研究中被發(fā)現(xiàn)[13,14]。因此，通過(guò)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因篩選這一種快速發(fā)現(xiàn)新型化合物的方法，能高效提升篩選速度。其中，PKS是一種多功能酶復(fù)合物，催化如阿維菌素、雷帕霉素、紅霉素等聚酮類(lèi)化合物的合成[15]；NRPS則是一種非核糖體肽合成酶，催化如環(huán)孢菌素、博來(lái)霉素、達(dá)托霉素等多肽類(lèi)化合物的合成[16]。Halo是一種具有修飾作用的酶，通過(guò)改變化合物的空間和電子效應(yīng)，賦予微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性，如黃素依賴(lài)型鹵化酶[17]。本研究選取廣西北部灣海域的3個(gè)站位，以其表層海水作為研究對(duì)象，通過(guò)4種分離培養(yǎng)基、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，獲取海水中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性信息，并利用PKSⅠ型、PKSⅡ型、NRPS和Halo合成基因，對(duì)可培養(yǎng)海洋細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行篩選，挖掘潛在合成活性代謝產(chǎn)物的能力，為深入研究表層海水來(lái)源的海洋細(xì)菌多樣性及其功能提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2021年8月中旬，采集廣西北部灣海域中3處站位的海水樣品，取樣點(diǎn)見(jiàn)圖1。3個(gè)站位分別為茅尾海(002站位)、珍珠港(073站位)和北侖河口(067站位)。對(duì)每個(gè)站位采集3 L表層海水(0.5 m深度)樣品。隨船記錄水溫、鹽度、pH值及溶解氧等環(huán)境參數(shù)，營(yíng)養(yǎng)鹽、化學(xué)需氧量(COD)、懸浮物及細(xì)菌總數(shù)等各指標(biāo)均待收集水樣后帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，研究細(xì)菌多樣性的水樣置于50 mL無(wú)菌離心管中，4℃低溫保藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)4種分離培養(yǎng)基：2216E固體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，改良高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基(GN培養(yǎng)基，可溶性淀粉10.0 g，葡萄糖1.0 g，甘油10 mL，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂14.0 g，去離子水1 000 mL)，P7固體培養(yǎng)基(L-酪氨酸0.5 g，L-天門(mén)冬酰胺1.0 g，甘油10 mL，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂14.0 g，去離子水1 000 mL，pH值7.2-7.4)，M5固體培養(yǎng)基(海藻糖5.0 g，脯氨酸1.0 g，瓊脂14.0 g，陳海水1 000 mL，pH值7.2-7.4)。復(fù)合鹽母液配方為KNO31.0 g，NaCl 15.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，NH4NO30.1 g，F(xiàn)eSO40.01 g，去離子水10 mL。

(2)純化培養(yǎng)基：改良ISP2固體培養(yǎng)基(麥芽提取粉2.0 g，酵母粉2.0 g，葡萄糖2.0 g，去離子水1 000 mL，海鹽25.0 g，瓊脂14.0 g)。

(3)含氨芐的LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，氨芐青霉素100 mg，瓊脂13.0 g，超純水1 000 mL，pH值為7.2-7.4。

1.2 方法

1.2.1 海水參數(shù)測(cè)定

作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀(JFE AAQ171，日本)測(cè)定水溫、鹽度、pH值及溶解氧；參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378.1-2007)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽(氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮、磷酸鹽及硅酸鹽)、化學(xué)需氧量、懸浮物濃度及細(xì)菌總數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 菌株分離純化

用無(wú)菌水將樣品稀釋成10-1、10-2和10-3濃度的樣液，取100 μL稀釋后的樣液涂布至4種固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度兩個(gè)平行，28℃培養(yǎng)5-7 d，挑取肉眼可見(jiàn)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù)，以30%(V∶V)甘油-ISP2混合液作為保護(hù)劑，將純化好的菌株保藏于-80℃。

1.2.3 16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

用無(wú)菌牙簽挑取少量培養(yǎng)好的菌苔，放置于裝有無(wú)菌 chelex-100樹(shù)脂[18]的管子中進(jìn)行研磨，100℃加熱10 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液(細(xì)菌的DNA)為PCR模板，再根據(jù)Walsh等[19]的方法對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和測(cè)序引物均為細(xì)菌通用引物27F和1492R，PCR反應(yīng)條件參照李菲等[8]的方法設(shè)定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。其中，潛在新物種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行切膠回收，將純化好的DNA連接pEASY-T1克隆載體上，轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落情況，隨機(jī)挑取5-6個(gè)菌落，用PCR法驗(yàn)證克隆的片段大小并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ezbiocloud.net)進(jìn)行在線比對(duì)[20]；選取同源性最高的菌株序列作為參比對(duì)象，運(yùn)用MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Boostrap 1 000次檢測(cè)各分支的置信值，對(duì)各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析[21]，并使用EvolView對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行美化處理[22]。采用Excel軟件計(jì)算Simpson、Shannon-Wiener和Pielou生物多樣性指數(shù)[23]，并用SPSS軟件分析可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性與海水理化參數(shù)的Pearson相關(guān)性。

1.2.4 抗生素合成基因的擴(kuò)增及檢測(cè)

對(duì)1.2.2節(jié)提取到的細(xì)菌DNA進(jìn)行NRPS、PKS和Halo基因擴(kuò)增。引物信息見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增參數(shù)參照文獻(xiàn)[24,25]的方法進(jìn)行設(shè)定。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣站位的海水理化性質(zhì)

取樣站位的環(huán)境特征與海水理化性質(zhì)如表2所示。3處取樣站位海水的營(yíng)養(yǎng)鹽含量、鹽度、化學(xué)需氧量和懸浮物濃度均存在較大差異，溫度、pH值、溶解氧含量等指標(biāo)差別不大。

表2 取樣站位的環(huán)境特征與海水理化性質(zhì)

2.2 表層海水中可培養(yǎng)細(xì)菌

本研究采集了廣西北部灣3處近岸海域的表層海水樣品，共獲得252株海洋細(xì)菌，隸屬于4門(mén)7綱20目25科37屬52種(圖2、圖3)。變形菌門(mén)(Proteobacteria，172株)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，43株)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，22株)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，15株)分別占總分離菌株的68.25%、17.06%、8.73%和5.95%[圖2(a)]。在綱水平，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，114株)細(xì)菌數(shù)最多，占總菌數(shù)的45.24%；其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，50株，19.84%)和放線菌綱(Actinomycetia，43株，17.06%)。此外，芽孢桿菌綱(Bacilli)、噬纖維菌綱(Cytophagia)、黃桿菌綱(Flavobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)分別包含22株、10株、5株和8株細(xì)菌[圖2(b)]。在屬水平(圖3)，假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株最多，分離出33株(3種)；其次是鏈霉菌屬(Streptomyces)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，分別獲得25株(4種)、21株(2種)和19株(4種)。此外，袁其鵬屬(Qipengyuania)、噬冷菌屬(Algoriphagus)、交替單胞菌屬(Alteromonas)和鹽單胞菌屬(Halomonas)中的菌種數(shù)分別為3個(gè)、3個(gè)、3個(gè)和2個(gè)，其余29個(gè)菌屬中均僅分離到1種細(xì)菌。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因相似度低于98.65%屬于不同物種的歸類(lèi)原則[26]，本研究共分離培養(yǎng)出10株細(xì)菌的潛在新種 (表3)，分別屬黃桿菌綱、噬纖維菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱，其數(shù)目分別為4株、1株、2株和3株。

表3 表層海水中潛在新型菌株

續(xù)表

圖2 表層海水可培養(yǎng)細(xì)菌在門(mén)(a)和綱(b)水平的組成分布

對(duì)不同站位分離的細(xì)菌類(lèi)群比較發(fā)現(xiàn)，002站位、067站位和073站位分別獲得細(xì)菌76株(21屬25種)、102株(23屬31種)和74株(16屬19種)(表4)。其中，有8個(gè)屬的細(xì)菌僅在002站位中分離得到，11個(gè)屬的細(xì)菌僅在067站位中分離得到，4個(gè)屬的細(xì)菌僅在073站位中分離獲得，而有9個(gè)屬的細(xì)菌在這3個(gè)站位均能分離得到(圖4)。對(duì)3處站位細(xì)菌多樣性與環(huán)境參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，銨鹽和溶解氧含量與細(xì)菌總數(shù)呈正相關(guān)性，存在顯著性差異(P<0.05)。細(xì)菌種類(lèi)與硅酸鹽、鹽度也存在顯著性差異，硅酸鹽、磷酸鹽和鹽度在3處海域的細(xì)菌多樣性上有顯著性差異(表5)，而海水中的亞硝酸鹽、硝酸鹽、懸浮物及海水的pH值、溫度、COD與3處海域的細(xì)菌多樣性不相關(guān)(P>0.05)。

表5 3處站位細(xì)菌多樣性與環(huán)境參數(shù)的Pearson相關(guān)性分析

續(xù)表

紅色三角符號(hào)表示該菌為潛在的新分類(lèi)單元

表4 3處站位及4種培養(yǎng)基中細(xì)菌屬級(jí)群類(lèi)分布

續(xù)表

圖4 3處站位來(lái)源海洋細(xì)菌屬級(jí)群類(lèi)的維恩分析

2.3 培養(yǎng)基的分離效果

采用4種分離培養(yǎng)基對(duì)表層海水中海洋細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，分離到細(xì)菌多樣性情況如表6所示。就多樣性指數(shù)可知，2216E培養(yǎng)基的Simpon指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou指數(shù)均高于M5、P7和GN培養(yǎng)基。在綱水平，α-變形菌綱、γ-變形菌綱、放線菌綱和芽孢桿菌綱的細(xì)菌在4種培養(yǎng)基均能分離獲得；2216E和M5培養(yǎng)基中均分離到β-變形菌綱、黃桿菌綱和噬纖維菌綱的細(xì)菌，P7培養(yǎng)基中分離到1株黃桿菌綱的細(xì)菌，GN則未分離到3個(gè)綱的細(xì)菌。在屬水平(表4)，2216E、M5、P7和GN培養(yǎng)基均獲得鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌，其中，優(yōu)勢(shì)類(lèi)群假單胞菌屬在GN培養(yǎng)基中菌株數(shù)目最多；作為本次分離培養(yǎng)的第二大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，鏈霉菌屬(Streptomyces)在2216E培養(yǎng)基中菌株數(shù)目最多，但在P7培養(yǎng)基中未分離到。此外，分別有7個(gè)、2個(gè)、2個(gè)與1個(gè)屬的細(xì)菌僅在2216E、M5、P7及GN培養(yǎng)基中被培養(yǎng)。其中，2216E培養(yǎng)基中分離出6株細(xì)菌的潛在新種，GN和P7培養(yǎng)基中各培養(yǎng)出3株和1株(表3)。

表6 不同培養(yǎng)基分離到細(xì)菌多樣性情況

2.4 抗生素合成基因的檢測(cè)結(jié)果

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)52種細(xì)菌是否存在次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的潛能，對(duì)其進(jìn)行PKS、NRPS和Halo基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增和電泳檢測(cè)結(jié)果(表7)顯示，22種細(xì)菌均至少擴(kuò)增出1條目的條帶，即其含有1種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因。其中，PKSⅡ基因在15株細(xì)菌中檢測(cè)到；Halo基因在13株細(xì)菌中檢測(cè)到，3株細(xì)菌含PKSⅠ基因和2株細(xì)菌檢測(cè)到NRPS基因，有10株細(xì)菌含2種或2種以上的生物合成基因簇。

表7 3類(lèi)生物合成基因在22種細(xì)菌中的分布

續(xù)表

3 討論

從總體上看，該研究區(qū)域中海水可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群與大多數(shù)前人研究報(bào)道[22,27]較為一致，主要由γ-變形菌、α-變形菌、擬桿菌和放線菌等優(yōu)勢(shì)菌群組成。其中，γ-變形菌類(lèi)群相對(duì)豐度最高(114株，45.24%)，同時(shí)檢測(cè)到海水中硝酸鹽、磷酸鹽、銨鹽等無(wú)機(jī)鹽濃度較高，兩者是否存在關(guān)聯(lián)，仍需要進(jìn)一步去考證。此外，3處海域海水中的細(xì)菌群落組成存在明顯差異。其中，細(xì)菌總數(shù)排序?yàn)檎渲楦?073站位)<茅尾海(002站位)<北侖河口(067站位)，細(xì)菌種類(lèi)排序?yàn)楸眮龊涌?067站位) >茅尾海(002站位)>珍珠港(073站位)。珍珠港(073站位)內(nèi)潮流暢通、水質(zhì)清澈,隨著養(yǎng)殖珍珠貝的數(shù)量減少，鋼鐵、火電和紙漿等工業(yè)快速發(fā)展，環(huán)境污染驟增，尤其是重金屬類(lèi)污染[28]。作為相同半封閉內(nèi)海,茅尾海(002站位)是廣西沿海最大的養(yǎng)殖區(qū)，由于受到周邊江水匯集和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的影響，海水中大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)聚集，重金屬污染加劇[29]。研究指出，重金屬污染物可迅速地與懸浮物和沉積物結(jié)合而沉入海底，海水中重金屬含量大大降低[30]。此外，海水的重金屬含量與細(xì)菌數(shù)量的分布呈不同程度的相關(guān)性，一定濃度的重金屬含量可對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用[30]。相比之下，敞開(kāi)式淺水港灣北侖河口具有連片生長(zhǎng)紅樹(shù)林，動(dòng)植物種類(lèi)組成和群落結(jié)構(gòu)隨海岸類(lèi)型變化而呈多樣化等特征，加速了海水運(yùn)動(dòng)，提升了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)反復(fù)置速率，使得該區(qū)域表層海水鹽度低，銨鹽、硅酸鹽和溶解氧含量高，更利于多種微生物生存。此外，海水運(yùn)動(dòng)驅(qū)使下，表層和底層菌群趨于平衡，進(jìn)而豐富細(xì)菌類(lèi)群組成。

本研究采用4種營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型與濃度差異較大的培養(yǎng)基，分別對(duì)北部灣3處海域表層海水進(jìn)行細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)。結(jié)果表明，2216E培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量最多，其次是M5培養(yǎng)基，P7和GN培養(yǎng)基分離到的最少。其中，GN培養(yǎng)基主要以淀粉、葡萄糖和甘油等碳源為主，常用于分離培養(yǎng)放線菌及觀察其形態(tài)特征；GN培養(yǎng)基中分離到的兩大放線菌類(lèi)群鏈霉菌和微桿菌，在廣西北部灣已發(fā)現(xiàn)的海洋細(xì)菌類(lèi)群中占最高比例，在土壤、水體和植物內(nèi)都占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[7,9]；GN培養(yǎng)基中未篩選到擬桿菌門(mén)類(lèi)群，大多數(shù)擬桿菌可產(chǎn)生多種功能的胞外酶[31]，而酶的合成與分泌需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是氮源[32]，故推測(cè)該類(lèi)群難以在單一營(yíng)養(yǎng)源的GN培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。相比較，2216E培養(yǎng)基更適合分離培養(yǎng)海水中的細(xì)菌，獲得潛在新分類(lèi)單元的菌株數(shù)高于其他培養(yǎng)基。因此，在分離海水中可培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型多元化來(lái)培養(yǎng)更多的細(xì)菌資源。

在52種細(xì)菌中，有22種細(xì)菌檢測(cè)出抗生素生物合成基因，總陽(yáng)性率為42.31%。相對(duì)于紅樹(shù)植物和沉積物來(lái)源細(xì)菌，本研究海水來(lái)源細(xì)菌中檢測(cè)到的抗生素生物合成基因率偏低，其可能原因是紅樹(shù)林生境中有機(jī)質(zhì)較其他海洋區(qū)域的豐富[33]，富含動(dòng)植物殘?bào)w的脂素、蛋白和纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使其菌落組成多樣化，可加快能量和物質(zhì)循環(huán)速度，增強(qiáng)生產(chǎn)力和有機(jī)質(zhì)的降解活性[34]。

4 結(jié)論

廣西北部灣海域表層海水中具有豐富的可培養(yǎng)細(xì)菌，具有較高的物種多樣性，蘊(yùn)藏著潛在新物種資源，且具有合成聚酮類(lèi)、非核糖體肽類(lèi)化合物及鹵化酶的潛能，為后續(xù)開(kāi)展拮抗菌篩選工作及其活性化合物的研究提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。