劉 博 任仲麗 曹魯娜 李秀菊 張裕民

作者單位：菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤 274000

咽炎片主要由玄參、天冬、麥冬、板藍(lán)根、薄荷油等成分組成，具有養(yǎng)陰潤肺、清熱解毒、清利咽喉、鎮(zhèn)咳止癢功效[1]。因處方中的多味藥具有抑菌作用[2-8]，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版四部1105 規(guī)定，采用增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、采用薄膜過濾法，上述幾種方法的聯(lián)合使用可消除供試品的抑菌活性。為了真實(shí)反映藥品中微生物污染狀況，本研究采用了常規(guī)法、增加培養(yǎng)基體積法和薄膜過濾法進(jìn)行檢查，以期建立咽炎片的微生物限度檢查方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品根據(jù)山東省藥品監(jiān)督管理局藥品質(zhì)量風(fēng)險監(jiān)測項目要求，選取10 個不同生產(chǎn)企業(yè)的咽炎片樣品。

1.1.2 菌種菌種微生物計數(shù)方法適用性試驗所用菌種為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]，控制菌檢查方法適用性試驗所用菌種為大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi-B）[CMCC(B)50094]，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，試驗所用菌株為第3 代。

1.1.3 儀器電子天平（JY2002，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、高壓蒸汽滅菌器（mLS-3780，三洋）、細(xì)菌濁度分析儀（WGZ-2XJ，上海盺瑞儀器儀表有限公司）、生物安全柜（Class Ⅱ BSC，新加坡ESCD 公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000B Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250F-1，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、微生物限度檢驗儀（HTY-302G，杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基與試劑胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基等由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。氯化鈉、聚山梨酯80 由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

對10 個不同企業(yè)生產(chǎn)的咽炎片進(jìn)行微生物方法適用性試驗。

1.2.1 菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門氏菌的新鮮培養(yǎng)物經(jīng)濁度計比濁后，用0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍系列稀釋制成100～10 000 cfu/ml 的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入10 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液（含0.05%聚山梨酯80）將孢子洗脫，經(jīng)濁度計比濁后，稀釋制成100～10 000 cfu/ml 的菌懸液，做活菌計數(shù)后備用。

1.2.2 供試液的制備 稱取供試品10 g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，溶解均勻后得1∶10的供試液。取1∶10 供試液1 ml 加pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10 ml，制成1∶100 的供試液，同理制得1∶1 000 的供試液。

1.2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證

1.2.3.1 常規(guī)法（1 ml/皿）試驗組：取5 個滅菌試管裝入9.9 ml 1.2.2 項下1∶10 的供試液，每個試管中依次加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 ml；供試品對照組：取相應(yīng)量的稀釋液代替菌液同試驗組操作；菌液對照組：取相應(yīng)量的稀釋液替代供試液同試驗組操作[9]。以上各組吸取1 ml 注入平皿中，平行制備2 個平皿，傾注15～20 ml 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置33 ℃培養(yǎng)3 d 計數(shù)；分別取白色念珠菌、黑曲霉的實(shí)驗組、供試品對照組和菌液對照組各1 ml 注入平皿中，平行制備2 個平皿，傾注15～20 ml 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置23 ℃培養(yǎng)5 d 計數(shù)。

1.2.3.2 增加培養(yǎng)基體積（0.2 ml/皿）試驗組：取5 個滅菌試管裝入9.9 ml 1.2.2 項下1∶10 的供試液，每個試管中依次加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 ml；供試品對照組：取相應(yīng)量的稀釋液代替菌液同試驗組操作；菌液對照組：取相應(yīng)量的稀釋液替代供試液同試驗組操作[9]。以上各組吸取2 ml 注入10 個平皿中，傾注15～20 ml 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置33 ℃培養(yǎng)3 d 計數(shù)；分別取白色念珠菌、黑曲霉的實(shí)驗組、供試品對照組和菌液對照組各2 ml 注入10 個平皿中，傾注15～20 ml 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置23 ℃培養(yǎng)5 d 計數(shù)。

1.2.3.3 薄膜過濾法試驗組：取1.2.2 項下1∶10的供試液1 ml 至100 ml pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，用稀釋液分3 次沖洗濾膜，100 ml/膜，在末次沖洗中依次加入制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液0.1 ml；供試品對照組：取相應(yīng)量的稀釋液代替菌液同試驗組操作；菌液對照組：取相應(yīng)量的稀釋液替代供試液同試驗組操作[9]。濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2 個平皿，33 ℃培養(yǎng)3 d 計數(shù)；分別取白色念珠菌、黑曲霉的實(shí)驗組、供試品對照組和菌液對照組各個濾膜，菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2 個平皿，置23 ℃培養(yǎng)5 d 計數(shù)。

1.2.4 回收率的計算試驗組菌回收率（%）=[（試驗組菌落數(shù)平均值－供試品對照組菌落數(shù)平均值）/菌液對照組菌落平均值]×100%，若3 次平行試驗中5 種菌回收率均在70%以上，則認(rèn)為結(jié)果符合驗證試驗。

1.2.5 控制菌的檢查

1.2.5.1 耐膽鹽革蘭陰性菌取供試品10 g 用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋制成1∶10 供試液，混勻，20～25 ℃培養(yǎng)2 h[9]，依次制成1∶100、1∶1 000的供試液。分別取1∶10、1∶100、1∶1 000 的供試液1 ml 接種至10 ml 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基作為供試品組；陽性對照組照供試品組配制，再加入小于100 cfu/ml 的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌懸液；陰性對照組以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。放置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，上述培養(yǎng)物劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.5.2 大腸埃希菌取1.2.2 項下的1∶10 的供試液10 ml 接種至100 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為供試品組；陽性對照組照供試品組配制，再加入小于100 cfu/ml 的大腸埃希菌菌懸液；陰性對照組以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將其1 ml 接種至100 ml 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)48 h，之后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)72 h[10]。

1.2.5.3 沙門菌取10 g 供試品直接接種于100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h 作為供試品組；陽性對照組照供試品組配制，再加入小于100 cfu/ml 的乙型副傷寒沙門氏菌菌懸液；陰性對照組以稀釋液代替供試品，其他同供試品組。取上述培養(yǎng)物0.1 ml 接種至10 ml RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h[10]。

2 結(jié)果

不同企業(yè)樣品的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于50%。見表1。增加培養(yǎng)基體積可適當(dāng)提高金黃色葡萄球菌的回收率，但枯草芽孢桿菌的回收率仍不能達(dá)到藥典的要求，又選擇薄膜過濾法再進(jìn)行驗證。見表2。采用薄膜過濾法各試驗菌的回收率均符合要求。見表3?？刂凭鷻z查采用常規(guī)法，陽性對照均檢出生長良好，陰性對照未檢出。見表4。

表1 常規(guī)法需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)方法平均回收率(%)

表2 增加培養(yǎng)基體積需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)方法平均回收率(%)

表3 薄膜過濾法需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)方法平均回收率(%)

表4 控制菌檢查驗證結(jié)果

3 討論

藥品微生物限度檢查指的是微生物對各種中藥、西藥的侵蝕及感染的程度，并對這種侵蝕程度進(jìn)行實(shí)驗驗證，在規(guī)定的試驗條件下，檢查樣品中存在微生物的數(shù)量以及是否存在特定微生物[10]。在檢驗過程中易受到各種因素的影響，不僅要遵循藥品檢驗的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，還要符合微生物的檢測要求，除了要牢記“無菌、快速、準(zhǔn)確”外還要謹(jǐn)記微生物的特殊性[11]。以最大程度保證微生物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低誤差率。

咽炎片處方中含有多種抑菌成分，具有抑菌作用的成分可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性[12]。雖然不同企業(yè)同名中藥制劑的成分基本相同，但其含量存在一定差異[13]，同一種中草藥由于不同來源、季節(jié)性變化、植物不同部位、不同提取方法導(dǎo)致其成分也有差別[4]。為了保證檢查方法的可靠性，本研究通過對10 個不同企業(yè)生產(chǎn)的50 批次的咽炎片樣品進(jìn)行了需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的方法驗證。結(jié)果表明金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌采用常規(guī)法和增加培養(yǎng)基體積法不能完全消除供試品的抑菌活性，說明咽炎片對需氧菌有較強(qiáng)的抑菌作用，應(yīng)重新選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行驗證。含有抑菌成分的中成藥往往對這兩種菌有作用，這與相關(guān)研究一致[14-15]。為進(jìn)一步驗證方法適用性結(jié)果的可行性，本研究選取了薄膜過濾法進(jìn)行再驗證，結(jié)果表明，采用薄膜過濾法各種菌的回收率在70%以上，因此選擇薄膜過濾法（300 ml/膜）對咽炎片進(jìn)行微生物計數(shù)檢查，符合方法適用性試驗要求。咽炎片的控制菌檢查方法有效性驗證試驗表明，10 個企業(yè)生產(chǎn)的50 批次的咽炎片均可使用常規(guī)法進(jìn)行檢查。結(jié)果完全符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部微生物限度檢查控制菌驗證要求，所以該方法可行。本試驗建立的方法準(zhǔn)確、可靠，適用于咽炎片的微生物限度檢查。