胡佳文，聶志娟，孫 毅，邵乃麟，李全杰，徐鋼春

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214081)

綠藻廣泛分布于淡水中，在海水中也有少量分布，種類繁多，包含小球藻、衣藻和團(tuán)藻等。大多數(shù)綠藻都含有葉綠體，可進(jìn)行光合自養(yǎng)，將二氧化碳、氮、磷等無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)光合作用轉(zhuǎn)變?yōu)楦邇r(jià)值次生代謝物，如衣藻富含淀粉和油脂、小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸和多種維生素。因此綠藻可作食品、飼料、化妝品以及藥業(yè)的重要原材料。綠藻物種豐富、分布廣泛，在淡水中的藻類品種亦是繁多，為合理地對(duì)單一藻種進(jìn)行深入研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用，需對(duì)淡水中的有益優(yōu)勢(shì)藻種進(jìn)行分離純化。本文從鱸魚養(yǎng)殖水體中分離得到了一株土著綠藻優(yōu)勢(shì)種。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，該土著藻種的形態(tài)特征與小球藻相似，經(jīng)ITS基因序列分子鑒定為小球藻。

一、材料與方法

1.分離純化

在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚(yáng)中基地加州鱸養(yǎng)殖池塘中，采集經(jīng)200目篩絹過(guò)濾除去大型浮游生物的水樣置于三角錐形瓶中，加入無(wú)菌BG11培養(yǎng)液進(jìn)行富集光照培養(yǎng)，1周后，顯微鏡下采用微吸管分離選取優(yōu)勢(shì)綠藻，并均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基。挑選生長(zhǎng)較好的單一綠色藻落進(jìn)行下一步的分離純化至顯微鏡下無(wú)其他雜藻可見(jiàn)。培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照周期夜∶晝＝12∶12，光照強(qiáng)度3000～5000勒克斯。

2.形態(tài)觀察

該綠藻優(yōu)勢(shì)種經(jīng)過(guò)分離純化后，在LB 固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，觀察藻落形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡10 倍×40 倍下觀察并拍照，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定。

3.分子鑒定

(1)DNA 提取與擴(kuò)增。采用6540-400 FastDNA Kit(Mpbio)試劑盒提取藻DNA。對(duì)ITS 基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’。

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR 反應(yīng)體系(25 微升)：DNA 模板1.0 微升、引物各1.0 微升(引物濃度10 微摩/升)、Taq Master MIX 12.5 微升、dH2O 9.5 微升，定容至25微升。

PCR 反應(yīng)程序：95℃5 秒，50℃10 秒，60℃150 秒，35 個(gè)循環(huán)，最后10℃保存。PCR 結(jié)束后從PCR儀上取下，待下一步處理。

(2)測(cè)序測(cè)定和分析。PCR 產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST在線比對(duì)分析，觀察比對(duì)結(jié)果，找到與原序列相似度最高的序列，并下載相關(guān)序列。通過(guò)Mega-X 軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并建立遺傳距離表，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的聚類結(jié)果進(jìn)行物種鑒定與遺傳關(guān)系分析。

二、結(jié)果

1.形態(tài)特征

光學(xué)顯微鏡觀察及培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1。藻株直徑在5～10微米。該藻株為單細(xì)胞藻，呈圓形或近圓形，表面光滑無(wú)凸起，無(wú)鞭毛。胞體鮮綠色。藻株在光學(xué)顯微鏡下的顏色、大小、形狀都符合小球藻的特征，可初步判定分離的綠藻為小球藻。

圖1 光學(xué)顯微鏡下藻株形態(tài)(左)及培養(yǎng)皿培養(yǎng)(右)

2.分子鑒定

實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增到該土著綠藻優(yōu)勢(shì)種的ITS基因序列，大小約751 bp，序列在NCBI 中進(jìn)行blast 同源性分析，結(jié)果顯示該序列與GenBank 中36 條序列具有很高的同源性(96%～100%)。比對(duì)結(jié)果顯示，與Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)的序列相似性最高，為100%，其次是Chlorella vulgaris isolate liming lake 1(MN103781.1)。獲取同源序列后，使用megaX 內(nèi)置的clustal W 進(jìn)行多序列比對(duì)，使用NJ 模型構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定bootstrap 為1000，選擇Marvania coccoides CCAP 251/1A(FR865696.1)作為外類群。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，與Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)聚為一支，同源性最高，自展值為100%，統(tǒng)計(jì)置信度處于非常顯著的水平且遺傳距離最小，為0.0040。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果與比對(duì)結(jié)果一致得出，分離純化的優(yōu)勢(shì)綠藻種為chlorella sorokiniana isolate SM12_1，屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬。

三、討論

本文通過(guò)微吸管分離和平板純化分離出一株綠藻優(yōu)勢(shì)種，并通過(guò)形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)鑒定明確了該藻株為小球藻。

本實(shí)驗(yàn)用顯微鏡觀察藻株形態(tài)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁、胞體直徑、顏色等形態(tài)特征與小球藻相符。形態(tài)特征雖然是分類學(xué)的重要依據(jù)之一，但不一定精確。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，許多浮游藻類存在表型可塑性，即一種基因型在不同的環(huán)境條件下呈現(xiàn)多種表型的現(xiàn)象(楊州，2008)。浮游藻類可能產(chǎn)生不同的表型以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境條件的變化，改變自身形態(tài)形成群體或集聚是最常見(jiàn)的一種形式(Huang，2018)。溫度、pH、鹽度等非生物因素可能誘導(dǎo)藻類發(fā)生形態(tài)變化，細(xì)菌、沉水性植物也可改變?cè)孱惐硇汀Ｓ醒芯堪l(fā)現(xiàn)金魚藻對(duì)小球藻有顯著的形態(tài)和生長(zhǎng)效應(yīng)(常孟陽(yáng)，2019)。普通小球藻對(duì)菹草有形態(tài)響應(yīng)，可促進(jìn)小球藻群體的形成(常孟陽(yáng)，2019)。因此，僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)來(lái)鑒定物種結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)。分子鑒定相比較形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果更精確。微藻體積微小，但對(duì)整個(gè)微藻進(jìn)行DNA測(cè)序工作量大且成本高昂，因此通常選取特異性基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序后與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源性比對(duì)，最終確定微藻的分類學(xué)地位。核基因組編碼的ITS序列變異位點(diǎn)數(shù)量豐富(曲凌云，2008)，是一個(gè)理想的微藻鑒定基因。由于小球藻形態(tài)特征明顯，綜合考慮鑒別效率和精確性，可先通過(guò)形態(tài)學(xué)大致判定種類，再結(jié)合分子鑒定進(jìn)一步確認(rèn)。

小球藻培養(yǎng)過(guò)程中積累了大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和類胡蘿卜素等高價(jià)值代謝產(chǎn)物，是天然綠色的魚苗開(kāi)口餌料，也是蝦類、貝類的優(yōu)質(zhì)餌料，還是用來(lái)培育供魚苗攝食的動(dòng)物性餌料如輪蟲(chóng)、枝角類等的優(yōu)質(zhì)基礎(chǔ)餌料。此外，小球藻可以用來(lái)進(jìn)行生物廢水修復(fù)以及水質(zhì)治理，治理效率高、成本低并且生態(tài)環(huán)保。因此，小球藻規(guī)?；ㄏ蚍€(wěn)定培養(yǎng)具有很大發(fā)展前景。本文分離純化一株綠藻并鑒定為小球藻，助力綠色養(yǎng)殖模式建立，豐富小球藻種質(zhì)資源，有助于推動(dòng)小球藻規(guī)?；ㄏ蛏a(chǎn)。