馮偉揚(yáng) 付傳博 閆佳慧 樂(lè) 園

(北京化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029)

引 言

磷酸奧司他韋(oseltamivir phosphate, OP)，化學(xué)式為C16H28N2O4·H3PO4，是一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑，用于預(yù)防和治療甲型、乙型流感[1]。中國(guó)流行性感冒診療方案推薦其作為流感抗病毒治療的首選藥物。同時(shí)，OP也被視為抑制COVID-19病毒的潛在藥物[2]。

流感病毒進(jìn)入人體后，必須與僅存在于呼吸道的唾液酸受體結(jié)合，因此呼吸道是流感病毒的主要攻擊目標(biāo)[3]。由于呼吸道感染是絕大多數(shù)病毒性疾病最常見(jiàn)的傳播途徑，因此將抗病毒藥物經(jīng)呼吸道直接遞送至肺部能夠提高藥物的靶向性和生物利用度。Valiulin等[4]將triazavirin超聲霧化形成氣溶膠，直接遞送至小鼠肺部，其生物利用度達(dá)到85%，是原口服劑型的4倍。Sahakijpijarn等[5]制備了瑞德西韋(remdesivir)干粉吸入劑，在吸入后20 h，藥物濃度仍超過(guò)半最大效應(yīng)濃度(EC50)，可持續(xù)發(fā)揮藥效。此外，還有研究表明肝素[6]、類(lèi)固醇類(lèi)藥物[7]等通過(guò)吸入給藥的方式也可以發(fā)揮抗病毒作用。

目前，OP的主要?jiǎng)┬褪强诜z囊和混懸液，不良反應(yīng)有惡心、嘔吐、腹瀉以及頭暈、頭痛、疲勞、失眠等[8]。如果以吸入劑的形式將OP遞送至肺部，與流感病毒直接產(chǎn)生作用，則很可能取得比傳統(tǒng)口服制劑更好的抗病毒效果，并且在一定程度上降低副作用的發(fā)生率。Tang等[9]采用脂質(zhì)體包裹OP制備了干粉吸入劑，但脂質(zhì)體的包封過(guò)程較為復(fù)雜，且制得的干粉吸入劑的體外肺部細(xì)微粒子沉積率(fine particle fraction, FPF)為35.40%，沉積效果有待提高。鄒佳輝等[10]將OP與亮氨酸、甘露醇相結(jié)合，采用噴霧干燥法制備了干粉吸入劑，其FPF為(36.2±2.8)%，體外肺部沉積效果一般，且制劑中OP含量較低，僅為20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。Aziz等[11]將OP分別與不同糖類(lèi)(海藻糖、甘露醇、葡萄糖)相結(jié)合，通過(guò)研磨制備干粉吸入劑，其FPF均大于70%，盡管該制劑的體外肺部沉積效果較佳，但并未對(duì)研磨過(guò)程中可能出現(xiàn)的藥物不均一現(xiàn)象進(jìn)行探究。

乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合糖蛋白，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有抑制效果，其中包括可能引起肺炎的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[12]，因此乳鐵蛋白可降低由病毒感染導(dǎo)致肺炎發(fā)生的可能性。將磷酸奧司他韋和乳鐵蛋白聯(lián)合使用，可以發(fā)揮抗病毒和抗菌的雙重療效，從而更有利于流感的治療。本文采用噴霧干燥法制備了磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)制劑配方及噴霧干燥工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化；考察了在優(yōu)化條件下制備的干粉吸入劑對(duì)正常人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)的毒性以及對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。本文結(jié)果可以為磷酸奧司他韋肺部遞送的相關(guān)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

磷酸奧司他韋原料藥(純度≥98%)，博瑞生物醫(yī)藥(蘇州)股份有限公司；磷酸奧司他韋標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、甘露醇(純度98%)、甲醇(純度≥99.9%，色譜級(jí))、乙腈(純度≥99.9%，色譜級(jí))，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳鐵蛋白(純度95%)，上海源葉生物科技有限公司；L-亮氨酸(純度99%)、磷酸二氫鉀(純度≥99.5%，色譜級(jí))，上海麥克林生化科技有限公司；羥丙基甲基纖維素(HPMC)膠囊(3號(hào))，蘇州膠囊有限公司。

人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEpiC)，25 cm2，北納生物科技有限公司；CCK-8試劑盒，500T，日本同仁化學(xué)研究所；金黃色葡萄球菌ATCC12600，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(500 mL)，美國(guó)HyClone公司；雙抗(青霉素+鏈霉素)(100 mL)、胎牛血清(FBS)(500 mL)，美國(guó)Gibco公司；酵母提取物、胰蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司；氯化鈉(分析純)，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂，BioRoYee公司。

1.2 干粉吸入劑的制備

稱(chēng)取500 mg磷酸奧司他韋、50 mg乳鐵蛋白、300 mg輔料(L-亮氨酸和甘露醇)，溶解于一定體積的純水中。用0.45 μm濾膜過(guò)濾，將過(guò)濾后的溶液用噴霧干燥器(B-290，瑞士Büchi公司)噴干，收集所得干粉，即為干粉吸入劑。

1.3 磷酸奧司他韋含量測(cè)定

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)OP含量。以水-甲醇-乙腈(體積比620∶245∶135)作為溶劑，將OP標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到待測(cè)溶液。檢測(cè)儀器為Waters 2695-2489型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，色譜柱為Waters-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)-甲醇-乙腈(體積比為620∶245∶135)，流速1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)207 nm，柱溫50 ℃，進(jìn)樣體積15 μL。

配制10～1 000 μg/mL的OP標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。以O(shè)P的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的回歸方程為：Y=17 992.0X+12 583.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 99,結(jié)果表明，在配制濃度范圍內(nèi)，Y與X之間的線性關(guān)系良好，可以利用該回歸方程測(cè)定OP含量。

1.4 干粉吸入劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.4.1微觀形貌和幾何粒徑

使用掃描電子顯微鏡(SEM)(JSM-7800F，日本JEOL公司)觀察樣品的微觀形貌。將少量樣品粘貼在樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，噴金，觀察干粉吸入劑顆粒的表面形貌、團(tuán)聚情況，并使用Nanomeasure軟件測(cè)量顆粒的幾何粒徑。

1.4.2收率

按照式(1)計(jì)算收率y。

(1)

式中：mi為所制備的磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑的質(zhì)量，mr為原料總質(zhì)量。

1.4.3密度及流動(dòng)性

取5 mL量筒，稱(chēng)其質(zhì)量為m0。向其中緩緩傾倒干粉吸入劑至一定體積V1，稱(chēng)量總質(zhì)量為m1。然后對(duì)量筒輕加震蕩，直至量筒中干粉吸入劑的體積不再發(fā)生變化，記錄此時(shí)粉末的體積為V2。分別按照式(2)和(3)計(jì)算堆積密度ρb和振實(shí)密度ρt。

(2)

(3)

卡爾指數(shù)(Carr’s index)用于表征干粉吸入劑的流動(dòng)性，其計(jì)算公式如式(4)所示?？栔笖?shù)越小，粉末的流動(dòng)性越好。一般認(rèn)為，當(dāng)卡爾指數(shù)小于20%時(shí)，粉末具有很好的流動(dòng)性。

(4)

式中：I為卡爾指數(shù)。

1.4.4晶型

采用X射線衍射儀(XRD)(2500VB2+PC，日本理學(xué)株式會(huì)社)測(cè)定樣品的晶型。將約20 mg干粉吸入劑輕輕倒入樣品槽中，用蓋玻片壓平。在電壓20 kV、電流2 mA的條件下，以10(°)/min的速度在3°～90°的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，檢測(cè)在各角度下粉末的吸收強(qiáng)度。

1.5 體外肺部細(xì)微粒子沉積率的測(cè)定

采用新一代藥用撞擊器(NGI)[13-14](英國(guó)Copley Scientific公司)測(cè)定干粉吸入劑的體外肺部沉積情況，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖1[15]所示。稱(chēng)取約25 mg干粉吸入劑填充至3號(hào)HPMC膠囊中。實(shí)驗(yàn)選取的流速為39 L/min，與人體的正常吸入流速類(lèi)似。干粉吸入劑經(jīng)吸入裝置進(jìn)入NGI，并按照空氣動(dòng)力學(xué)直徑(Da)由大到小的順序被截留在各級(jí)收集盤(pán)上。在此流速下，各級(jí)收集盤(pán)的截至Da分別為：10.17 μm(1級(jí))、5.58 μm(2級(jí))、3.50 μm(3級(jí))、2.03 μm(4級(jí))、1.18 μm(5級(jí))、0.71 μm(6級(jí))、0.45 μm(7級(jí))、0 μm(MOC級(jí))。選取的吸入體積為4 L，計(jì)算出單次吸入時(shí)間約為6.2 s。每次實(shí)驗(yàn)吸入膠囊3粒(共75 mg)，與目前OP膠囊的單次服用劑量相同。使用Breezhaler吸入器(NeohalerTM，諾華生物醫(yī)學(xué)研究有限公司)作為吸入裝置進(jìn)行測(cè)試，其余操作均按照《中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)第四部》[14]進(jìn)行。

圖1 NGI內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖[15]

測(cè)試結(jié)束后，分別收集膠囊、吸入裝置、NGI模擬喉部及各級(jí)收集盤(pán)中的干粉吸入劑，并采用1.3節(jié)的方法測(cè)定各處的OP含量。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

體外肺部細(xì)微粒子沉積率是指NGI中2級(jí)至MOC級(jí)的藥物(OP)沉積總量占單次測(cè)試總主藥量的百分比，計(jì)算公式如下。

(5)

式中：F為干粉吸入劑的體外肺部細(xì)微粒子沉積率，Mi為OP在第i級(jí)中的沉積量，MMOC為OP在MOC級(jí)中的沉積量，∑M為OP總質(zhì)量(包括膠囊、吸入裝置、NGI模擬喉部、第1～7級(jí)及MOC級(jí)收集盤(pán)中OP的質(zhì)量)。

測(cè)試后，將各處的OP沉積量輸入配套軟件CITDAS中，可計(jì)算得到各樣品的空氣動(dòng)力學(xué)直徑Da。

1.6 細(xì)胞毒性測(cè)定

采用CCK-8法測(cè)試OP原料藥及干粉吸入劑的細(xì)胞毒性。HPAEpiC細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的條件下置于CO2培養(yǎng)箱(311，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至約80%匯合后，用胰蛋白酶消化，得到細(xì)胞懸液。使用完全培養(yǎng)基(含10% FBS和1%雙抗的1640培養(yǎng)基)稀釋細(xì)胞懸液至濃度約為6×104個(gè)細(xì)胞/mL。在無(wú)菌96孔板中加入細(xì)胞懸液(100 μL/孔)，并在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h使其貼壁生長(zhǎng)。

使用無(wú)血清培養(yǎng)基(含1%雙抗的1640培養(yǎng)基)分別將OP原料藥和干粉吸入劑溶解稀釋?zhuān)♂尩馁|(zhì)量濃度梯度區(qū)間為500～1 000 μg/mL，干粉吸入劑對(duì)應(yīng)的OP質(zhì)量濃度約為294～588 μg/mL。

在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%～80%匯合，吸去各孔培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。隨后，在每孔中加入不同質(zhì)量濃度的OP原料藥稀釋液或干粉吸入劑稀釋液100 μL，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h。然后吸去各孔溶液，用PBS沖洗。各孔中加入提前用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋10倍的CCK-8試劑100 μL，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)約2 h。然后使用酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白組(未接種細(xì)胞、未加入藥液)及對(duì)照組(僅接種細(xì)胞、未加入藥液)。按照式(6)計(jì)算細(xì)胞存活率Rs。

(6)

式中：A為各實(shí)驗(yàn)組的吸光度，Ab為空白組的吸光度，A0為對(duì)照組的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

1.7 抑菌能力測(cè)定

采用梯度稀釋法測(cè)定干粉吸入劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力。將在優(yōu)化條件下制備的含乳鐵蛋白的4 mg干粉吸入劑溶解在4 mL LB培養(yǎng)基(含0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))中，接種40 μL金黃色葡萄球菌，在搖床中培養(yǎng)12 h。用無(wú)菌水將細(xì)菌懸液梯度稀釋至1×103CFU/mL。取稀釋后的細(xì)菌懸液100 μL，涂布在瓊脂培養(yǎng)基(含0.5%氯化鈉、0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1.5%瓊脂)上，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h，記錄菌落數(shù)?？瞻捉M的LB培養(yǎng)基中不加入任何藥物，對(duì)照組的LB培養(yǎng)基中加入在優(yōu)化條件下制備的不含乳鐵蛋白的干粉吸入劑，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。按照式(7)計(jì)算抑菌率Ra。

(7)

式中：a0為空白組的菌落數(shù)，a1為實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本課題組前期通過(guò)單因素試驗(yàn)，根據(jù)干粉吸入劑的造粒情況、幾何粒徑大小、表面形貌及團(tuán)聚程度，對(duì)干粉吸入劑的配方及噴干工藝參數(shù)進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定了較優(yōu)的條件為：磷酸奧司他韋500 mg、乳鐵蛋白50 mg、m(主藥)∶m(輔料)=5∶3，噴霧干燥器的進(jìn)口溫度為120 ℃，旋風(fēng)強(qiáng)度為100%。對(duì)仍未確定的4個(gè)因素：m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)、溶液體積、進(jìn)料速率、氣體流量，采用正交試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，各因素的水平及試驗(yàn)方案分別如表1和表2所示。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

表2 正交試驗(yàn)方案

2.1.2干粉吸入劑的微觀形貌及幾何粒徑

按照正交試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，制備9批磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察吸入劑顆粒的表面形貌、團(tuán)聚情況及幾何粒徑大小，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，樣品1、2、3為圓整的球形顆粒，表面較為光滑；樣品4、5、6雖然仍呈現(xiàn)圓整的球形顆粒，但相較于前3組樣品，其表面出現(xiàn)較多的褶皺；樣品7、8、9均有呈“空穴”狀的顆粒出現(xiàn)，表面褶皺中產(chǎn)生“捕獲效應(yīng)”，即有小顆粒被包裹在空穴中[16]。當(dāng)m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)相同時(shí)，樣品的表面微觀形貌相似；當(dāng)m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)發(fā)生改變時(shí)，樣品的表面微觀形貌會(huì)發(fā)生較為明顯的變化。這種現(xiàn)象可能是由于L-亮氨酸具有一定的疏水性，在液滴干燥的過(guò)程中會(huì)增加顆粒表面的吸引力，最終引起顆粒表面微觀形貌的改變[17]。

圖2 不同試驗(yàn)條件(試驗(yàn)號(hào))下制備的磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑的SEM圖

2.1.3干粉吸入劑的收率及粉體學(xué)性質(zhì)

表3為各組干粉吸入劑的收率及粉體學(xué)性質(zhì)。從結(jié)果中可以看出各組樣品的平均幾何粒徑差別并不顯著。其中，樣品1和3由于顆粒間出現(xiàn)了較為明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，因此其平均幾何粒徑較大；樣品7和8有較多呈“空穴”狀的顆粒出現(xiàn)，因此其平均幾何粒徑大于其他各組。

表3 干粉吸入劑的收率及粉體學(xué)性質(zhì)

干粉吸入劑的收率在48%～71%之間，未能達(dá)到較高的收率水平。導(dǎo)致這一結(jié)果的主要原因是顆粒的平均幾何粒徑較小[18]，處于1～2 μm左右的顆粒之間的內(nèi)聚力較非納微級(jí)的大顆粒強(qiáng)，且容易產(chǎn)生靜電作用，宏觀上會(huì)降低干粉吸入劑粉末的流動(dòng)性，使制備的干粉吸入劑難以從噴霧干燥器中取出，導(dǎo)致收率降低。

9組干粉吸入劑的堆積密度和振實(shí)密度差別不大，堆積密度均小于0.3 g/mL，振實(shí)密度均小于0.4 g/mL，二者均較小，有利于干粉吸入劑的分散。

與收率結(jié)果類(lèi)似，由于干粉吸入劑的平均幾何粒徑較小，導(dǎo)致范德華力、靜電力和毛細(xì)作用力明顯，因此干粉吸入劑的流動(dòng)性普遍較差。其中，樣品1、3、4、6的卡爾指數(shù)均大于26%，流動(dòng)性差；樣品2、5、7、8的卡爾指數(shù)在20%～26%之間，流動(dòng)性尚可；樣品9的卡爾指數(shù)為18.48%，流動(dòng)性最佳。

2.1.4干粉吸入劑的體外肺部沉積情況

體外肺部細(xì)微粒子沉積率FPF是評(píng)價(jià)干粉吸入劑質(zhì)量的最關(guān)鍵指標(biāo)，而空氣動(dòng)力學(xué)直徑Da影響干粉吸入劑在肺部的沉積情況。各組樣品的Da和FPF結(jié)果如表4所示。

表4 干粉吸入劑的空氣動(dòng)力學(xué)直徑Da及體外肺部細(xì)微粒子沉積率FPF

樣品1的FPF很小，結(jié)合SEM結(jié)果，分析其原因可能是由于樣品1的團(tuán)聚比較嚴(yán)重，吸入過(guò)程中未能很好地分散，因此粒徑較大，導(dǎo)致大部分顆粒被截留在NGI的第1級(jí)收集盤(pán)，無(wú)法進(jìn)一步向更深層遞送。樣品3的FPF也較小，原因可能是樣品3與HPMC膠囊間的靜電作用較強(qiáng)，顆粒大部分存留于膠囊中，沒(méi)有很好地從吸入裝置中遞送出來(lái)。樣品2由于團(tuán)聚現(xiàn)象不明顯，顆粒的分散性較好，有利于干粉吸入劑的霧化分散，因此其FPF較大。樣品4和6大部分存留在膠囊中，未能有效地遞送出吸入裝置，導(dǎo)致其FPF很小，原因是樣品與HPMC膠囊間的靜電作用較強(qiáng)。結(jié)合SEM結(jié)果可知，樣品5的粒徑分布比樣品4和6更為均勻，顆粒間的接觸面積較小，可減少粒子間的接觸摩擦，因而靜電作用有所減弱，使FPF增大。樣品7～9的FPF較前6組樣品均有明顯提高，且Da在2～5 μm范圍內(nèi)，適合肺部吸入。分析其主要原因是隨著L-亮氨酸添加量的進(jìn)一步提高，在干燥過(guò)程中液滴表面有更多疏水性L-亮氨酸富集，因此可以提升干粉吸入劑的霧化性能[18]。相較于樣品7和8而言，樣品9產(chǎn)生的具有“空穴”的大顆粒較少，粒徑分布更為均勻，更有利于細(xì)微粒子向深層遞送，其FPF高達(dá)75.613%。

樣品7～9中OP在各處的沉積情況見(jiàn)圖3。由結(jié)果可知，樣品7和8在第3級(jí)收集盤(pán)中的OP沉積率最高，樣品9在第4級(jí)收集盤(pán)中的OP沉積率最高。而這3組樣品在膠囊、吸入裝置、NGI模擬喉部及第1級(jí)收集盤(pán)中的OP沉積率都較低，表明大部分干粉吸入劑被有效遞送到第2級(jí)至MOC級(jí)，有利于干粉吸入劑在肺部直接發(fā)揮作用。

圖3 樣品7～9中磷酸奧司他韋在各部位的沉積情況

2.1.5正交試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)得到的磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑的收率、卡爾指數(shù)、Da及FPF結(jié)果，采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法(Z分綜合評(píng)價(jià)法)對(duì)試驗(yàn)中選取的各個(gè)水平進(jìn)行綜合評(píng)定。Z分綜合評(píng)價(jià)法的計(jì)算方法如下。

(8)

∑Zi=∑Zi,h-∑Zi,l

(9)

表5 正交試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)極差大小，得到正交試驗(yàn)中各因素對(duì)干粉吸入劑性質(zhì)影響的大小順序：A(m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇))>C(進(jìn)料速率)>B(溶液體積)>D(氣體流量)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，干粉吸入劑的較優(yōu)配方及噴霧干燥條件為A3B2C3D3，即：m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)=3∶0，溶液體積40 mL，進(jìn)料速率6.4 mL/min，氣體流量473 L/h。

由上述極差分析結(jié)果可知，m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)是影響干粉吸入劑性質(zhì)的最主要因素。此外，干粉吸入劑表面的靜電作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響也較大。而表面靜電作用受配方、含水量、顆粒表面的粗糙程度及粒徑均勻程度等因素的綜合影響，情況較為復(fù)雜。通過(guò)比較FPF與卡爾指數(shù)可以看出，當(dāng)干粉吸入劑的流動(dòng)性較好時(shí)，其體外肺部沉積情況也較好。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是流動(dòng)性的提高有利于膠囊的罐裝，同時(shí)也有利于干粉吸入劑向更深層遞送。

2.2 干粉吸入劑的XRD結(jié)果

圖4為各原料以及在優(yōu)化條件下制備的磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑的XRD譜圖。從結(jié)果中可以看出：OP原料藥在2θ約為5°、13°、14°、15°、16°、19°、21°、26°處具有明顯的衍射峰；L-亮氨酸在2θ約為6°、12°、24°、30°和37°處有明顯的衍射峰；而乳鐵蛋白沒(méi)有明顯的衍射峰，呈無(wú)定形狀態(tài)；在優(yōu)化條件下采用噴霧干燥法制備的干粉吸入劑在2θ為6°和19°處存在衍射峰，兩峰分別對(duì)應(yīng)L-亮氨酸和OP原料藥的特征峰，但峰形與原料相比明顯變寬，表明在噴霧干燥過(guò)程中原料晶型遭到一定程度的破壞，僅有少部分晶型保留，這與噴霧干燥法易產(chǎn)生無(wú)定形狀態(tài)物質(zhì)的趨勢(shì)一致。

圖4 OP原料藥、L-亮氨酸、乳鐵蛋白以及在優(yōu)化條件下制備的干粉吸入劑的XRD譜圖

2.3 干粉吸入劑的細(xì)胞毒性與抑菌作用

OP原料藥及在優(yōu)化條件下制備的干粉吸入劑對(duì)HPAEpiC細(xì)胞的毒性測(cè)試結(jié)果如圖5所示。由結(jié)果可知，OP原料藥和干粉吸入劑的細(xì)胞存活率均隨其質(zhì)量濃度的降低而逐漸增大，表明其細(xì)胞毒性逐漸減弱。當(dāng)干粉吸入劑的質(zhì)量濃度不高于600 μg/mL(所含OP的質(zhì)量濃度約為353 μg/mL)時(shí)，HPAEpiC細(xì)胞的存活率均大于90%，因此可以認(rèn)為在此濃度范圍內(nèi)干粉吸入劑對(duì)HPAEpiC細(xì)胞幾乎沒(méi)有損傷作用。產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因是干粉吸入劑中除了磷酸奧司他韋外，還加入了輔料L-亮氨酸及乳鐵蛋白。L-亮氨酸是人體必需氨基酸之一，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Wang等[19]的研究結(jié)果一致。乳鐵蛋白作為一種人體自身分泌的蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于肺癌靶向藥物的開(kāi)發(fā)[20-21]，目前還沒(méi)有對(duì)肺部細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒害作用的報(bào)道。綜上所述，由于加入的輔料對(duì)肺部細(xì)胞均沒(méi)有明顯的毒害作用，因此，在相同的質(zhì)量濃度下干粉吸入劑相較于OP原料藥對(duì)正常肺部細(xì)胞的毒性有所減弱。這一結(jié)果與Yan等[22]的研究結(jié)果一致。

圖5 磷酸奧司他韋原料藥及優(yōu)化的干粉吸入劑對(duì)HPAEpiC細(xì)胞的毒性

采用梯度稀釋法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)試了干粉吸入劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，結(jié)果如圖6所示?？瞻捉M、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)分別為80、76和62，其菌落總數(shù)均在30～300之間，達(dá)到菌落計(jì)數(shù)法的實(shí)驗(yàn)要求。由結(jié)果可知，對(duì)照組的菌落數(shù)相較于空白組沒(méi)有明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)相較于空白組和對(duì)照組明顯減少，表明含有乳鐵蛋白的干粉吸入劑(1 mg/mL)對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，抑菌率為22.50%。優(yōu)化的干粉吸入劑中含有的乳鐵蛋白具有金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，可與金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)和代謝所需的Fe3+螯合，從而產(chǎn)生抑菌作用[23-25]。

圖6 添加乳鐵蛋白對(duì)干粉吸入劑抑制金黃色葡萄球菌效果的影響

3 結(jié)論

(1)本文在前期單因素試驗(yàn)初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)一步優(yōu)化了磷酸奧司他韋-乳鐵蛋白干粉吸入劑的配方及噴霧干燥工藝參數(shù)，得到優(yōu)化的制備條件為：m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)=3∶0，溶液體積40 mL，進(jìn)料速率約6.4 mL/min，氣體流量約473 L/h。

(2)考察了在優(yōu)化條件下制備的干粉吸入劑對(duì)HPAEpiC細(xì)胞的毒性以及對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，結(jié)果表明：當(dāng)干粉吸入劑的質(zhì)量濃度低于600 μg/mL時(shí)，干粉吸入劑對(duì)HPAEpiC細(xì)胞幾乎沒(méi)有損傷作用；在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，干粉吸入劑對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，抑菌率為22.50%。