王志慧，項(xiàng)華中，鄭 剛，許穎原

（1．上海理工大學(xué) 上海市介入醫(yī)療器械工程研究中心，上海 200093；2．上海薩迦生物科技有限公司，上海 201203）

引 言

惡性腫瘤（即癌癥）的發(fā)病率、死亡率逐年升高[1]，原因是腫瘤在早期并沒(méi)有明顯的臨床癥狀，等到發(fā)現(xiàn)時(shí)已到了中晚期[2]，所以，尋求有效降低死亡率的方法尤為重要。研究表明，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低死亡率的有效途徑[3-4]，然而，常用的檢測(cè)方法，如CT、核磁共振（MRI）等，不僅對(duì)人體存在一定程度的損害，而且檢測(cè)費(fèi)用昂貴[5-6]，并不適合定期檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，血清中腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)對(duì)腫瘤的早期篩查、療效檢測(cè)、預(yù)后評(píng)估等方面具有重要的臨床意義[7-8]。腫瘤標(biāo)志物是指因惡性腫瘤存在或機(jī)體對(duì)其反應(yīng)而異常產(chǎn)生或升高的一種特征性物質(zhì)，在正常人體細(xì)胞中沒(méi)有或者含量很低[9-10]，臨床上，常把腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)作為腫瘤診斷的重要輔助手段。由于腫瘤標(biāo)志物的低特異性，單一腫瘤標(biāo)志物不足以診斷癌癥，而多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在成本控制、分析時(shí)間、所需樣本量等方面存在優(yōu)勢(shì)[8,11-13]，因此，多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)分析引起越來(lái)越多的關(guān)注。

多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的分析方法主要有基于電化學(xué)發(fā)光（ECLIA）的微流控芯片檢測(cè)法[13]、基于化學(xué)發(fā)光（CLIA）的多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)[14]等?；陔娀瘜W(xué)發(fā)光的微流控芯片檢測(cè)法多用于即時(shí)檢測(cè)（POCT）領(lǐng)域，可對(duì)單人份進(jìn)行快速檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間可控制在15 min內(nèi)，然而，該方法并不適合大規(guī)模人群的檢測(cè)?；诨瘜W(xué)發(fā)光的多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)采用雙抗體夾心的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，兼具化學(xué)發(fā)光法和蛋白芯片法的優(yōu)點(diǎn)，即檢測(cè)背景低、成本低、檢測(cè)速度快、通量高、所需樣本量少等，但因采用化學(xué)發(fā)光法，存在易受反應(yīng)環(huán)境影響、反應(yīng)時(shí)間難控制等缺點(diǎn)。

免疫熒光分析法（IFA）[15]是腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的常用方法之一。IFA是用熒光染料直接標(biāo)記待測(cè)血清中的腫瘤標(biāo)志物抗原，或用熒光染料標(biāo)記的二抗與蛋白芯片上的待測(cè)抗原結(jié)合，然后通過(guò)熒光掃描儀對(duì)標(biāo)記的熒光染料激發(fā)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，最后計(jì)算出待測(cè)血清中抗原的濃度。目前，IFA中用于熒光標(biāo)記的多為Cy3、Cy5等處于可見(jiàn)光波段的熒光染料，相比于CLIA具有背景噪聲高、易受蛋白質(zhì)自發(fā)熒光的干擾等缺點(diǎn)。由于組織蛋白自發(fā)熒光處于可見(jiàn)光范圍，在近紅外波段有較低的吸收和散射[16]，因此，選用光譜處于近紅外波段的熒光染料標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物的蛋白芯片法不僅具有背景噪聲低、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具備通量大、易操作、成本低、特異性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)[17]。

生物芯片掃描儀是蛋白芯片檢測(cè)的重要工具[18]，是蛋白芯片檢測(cè)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物上熒光信號(hào)強(qiáng)度的大小來(lái)定量分析血清中腫瘤標(biāo)志物抗原的濃度。生物芯片掃描儀的性能對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有重要的影響，在當(dāng)下市場(chǎng)，并沒(méi)有專(zhuān)門(mén)用于近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片的檢測(cè)儀器。基于此，根據(jù)蛋白芯片的特點(diǎn)及檢測(cè)需求，研制了用于蛋白芯片檢測(cè)的生物芯片掃描儀。與市場(chǎng)上存在的電化學(xué)發(fā)光或化學(xué)發(fā)光類(lèi)的檢測(cè)儀器相比，該掃描儀具有信噪比高、線性范圍寬、靈敏度高、分辨率高、使用方便、可減少芯片中多人份樣本之間的交叉污染等優(yōu)點(diǎn)。

本文通過(guò)近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片法定量檢測(cè)血清中的多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的含量，實(shí)現(xiàn)了多項(xiàng)癌癥的一次性篩查。文中詳細(xì)闡述了近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片多腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合定量檢測(cè)原理，并比較了10例患者血清的4項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)與羅氏電化學(xué)發(fā)光法儀器的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明二者高度相關(guān)。

1 近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片定量檢測(cè)原理

1.1 近紅外熒光標(biāo)記多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片免疫分析原理

近紅外熒光標(biāo)記多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片采用雙抗體夾心的近紅外熒光標(biāo)記法檢測(cè)，在固相載體上按一定的順序（或方法）包被多種帶有不同腫瘤標(biāo)志物靶標(biāo)的抗體，捕獲被檢者血清中對(duì)應(yīng)腫瘤標(biāo)志物的抗原，再結(jié)合生物素化的第二抗體（即二抗），然后與近紅外熒光染料標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行非特異性結(jié)合，最后通過(guò)生物芯片掃描儀檢測(cè)分析，獲得被檢者血清中各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物含量的生物信息，實(shí)現(xiàn)血清中多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)。近紅外熒光標(biāo)記多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片免疫分析原理如圖1所示。

圖1 近紅外熒光標(biāo)記多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片免疫分析原理Fig. 1 The principle of immunoassay for near-infrared fluorescent-labeled multi-tumor markers protein chip

對(duì)于多孔板來(lái)說(shuō)，每個(gè)孔板內(nèi)的反應(yīng)相同。首先，將帶有不同腫瘤標(biāo)志物靶標(biāo)的捕獲抗體固定于修飾過(guò)的固相載體的指定位置上，為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，帶有同樣腫瘤標(biāo)志物靶標(biāo)的捕獲抗體可重復(fù)固定幾個(gè)位置。然后加入待測(cè)血清進(jìn)行孵育，捕獲抗體會(huì)與血清中相應(yīng)腫瘤標(biāo)志物的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，待充分反應(yīng)后，清洗掉多余的血清，再加入不同腫瘤標(biāo)志物生物素化的第二抗體（即二抗），二抗與之前抗體-抗原對(duì)中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，待充分的孵育反應(yīng)后，清洗掉多余的二抗，再加入近紅外熒光染料標(biāo)記的鏈霉親和素，鏈霉親和素與生物素之間發(fā)生非特異性結(jié)合，待充分反應(yīng)后，將多余的鏈霉親和素清洗干凈。此時(shí)，近紅外熒光染料的分子數(shù)與血清中的腫瘤標(biāo)志物抗原濃度正相關(guān)，熒光染料的發(fā)光強(qiáng)度（I）正比于熒光染料分子的摩爾消光系數(shù)（ε）、量子產(chǎn)率（Q）以及熒光染料的摩爾濃度（C）[19]，即

式中K為常系數(shù)。

對(duì)于單位體積的近紅外熒光染料，其熒光分子數(shù)（N）與近紅外熒光染料的摩爾濃度（C）之間的關(guān)系為

式中阿伏伽德羅常數(shù)NA=6.02×1023mol-1。

根據(jù)式（1）、式（2），可得

由式（3）可知，熒光染料的發(fā)光強(qiáng)度與熒光分子數(shù)成正比，即熒光分子數(shù)越多，發(fā)射的熒光越強(qiáng)。

在上述蛋白芯片反應(yīng)過(guò)程中，通常會(huì)選擇指定數(shù)量的孔位，將加入待測(cè)血清這一環(huán)節(jié)用已知濃度的不同腫瘤標(biāo)志物抗原取代，并按抗原濃度由低到高（或由高到低）的順序分別加入各個(gè)孔位中，其余反應(yīng)過(guò)程與其他孔位相同。生物芯片掃描儀檢測(cè)分析后，根據(jù)檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值與相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物抗原濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將待測(cè)血清的熒光信號(hào)強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，線性回歸得到相應(yīng)的抗原濃度值，最終實(shí)現(xiàn)不同腫瘤標(biāo)志物抗原濃度的定量檢測(cè)。

1.2 生物芯片掃描儀的工作原理及設(shè)計(jì)

生物芯片掃描儀的結(jié)構(gòu)主要由光學(xué)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)掃描系統(tǒng)、電氣控制系統(tǒng)、信號(hào)處理放大系統(tǒng)和軟件分析系統(tǒng)5部分構(gòu)成，其工作原理如圖2所示。

圖2 生物芯片掃描儀工作原理Fig. 2 Working principle of biochip scanner

生物芯片掃描儀采用激光共聚焦原理結(jié)合機(jī)械掃描的方式完成近紅外熒光標(biāo)記多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片的掃描成像。電氣控制系統(tǒng)控制光學(xué)系統(tǒng)中激光器的溫度和電流，使得激光器能夠穩(wěn)定地工作，激發(fā)光路激發(fā)腫瘤標(biāo)志物上的熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，經(jīng)發(fā)射光路收集、光電轉(zhuǎn)換后變?yōu)殡娦盘?hào)，再經(jīng)信號(hào)處理放大系統(tǒng)的信號(hào)放大、濾波、A/D轉(zhuǎn)換，進(jìn)入軟件分析系統(tǒng)成像。近紅外熒光標(biāo)記多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片位于運(yùn)動(dòng)掃描系統(tǒng)中X軸的載物平臺(tái)，電氣控制系統(tǒng)控制運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)三軸的走位和掃描，完成整個(gè)蛋白芯片的掃描。

為了實(shí)現(xiàn)多孔位的單獨(dú)反應(yīng)，近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片采用固定裝置將固相載體上的各個(gè)微陣列隔開(kāi)，同時(shí)，為了使反應(yīng)更充分，固定裝置需要有一定的深度容納足夠多的反應(yīng)液。待反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)蛋白芯片時(shí)，需要去除固定裝置，這樣不僅使得操作復(fù)雜，而且容易損壞芯片，造成芯片中不同人份樣本之間的交叉感染。所以，在設(shè)計(jì)儀器時(shí)，需考慮固定裝置的尺寸、檢測(cè)的要求以及能容忍的最大軸向分辨率等因素[20]。

因此，在對(duì)上述因素綜合考慮的基礎(chǔ)上，并結(jié)合近紅外熒光染料的吸收發(fā)射光譜等條件，對(duì)光學(xué)系統(tǒng)中的元器件參數(shù)進(jìn)行選型設(shè)計(jì)，最終研制出了可用于近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片檢測(cè)的生物芯片掃描儀（生物芯片掃描儀的詳細(xì)工作原理及光路設(shè)計(jì)請(qǐng)查閱參考文獻(xiàn)[17]中1.3節(jié)《生物芯片掃描儀的檢測(cè)原理》）。

2 血清檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果

2.1 血清檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

選用文中介紹的近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片（上海薩迦生物科技有限公司蛋白芯片試劑盒）檢測(cè)10例不同患者樣本血清（血清樣本來(lái)自醫(yī)療機(jī)構(gòu)：上海薩迦生物科技有限公司），用生物芯片掃描儀分析檢測(cè)數(shù)據(jù)；用羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀（cobas e411）對(duì)同樣的樣本血清按指標(biāo)糖類(lèi)抗原（CA125）、癌胚抗原（CEA）、糖類(lèi)抗原（CA19-9）、甲胎蛋白（AFP）的順序分別進(jìn)行檢測(cè)，比較兩儀器的測(cè)量結(jié)果。

2.2 結(jié)果和討論

生物芯片掃描儀對(duì)蛋白芯片試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，得到CA125、CEA、CA19-9、AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

利用羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀（cobas e411）和近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片法對(duì)10例樣本血清4項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 羅氏分析儀和生物芯片掃描儀對(duì)血清樣本的檢測(cè)結(jié)果Tab. 1 Test results of serum samples from the Roche analyzer and biochip scanner

根據(jù)羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀和近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片對(duì)10例樣本血清的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)Excel軟件，以羅氏儀器的檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，以生物芯片掃描儀的檢測(cè)結(jié)果為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，如圖4所示。

由圖4可以看到，兩儀器對(duì)血清中的CA125、CEA、CA19-9和AFP含量的檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)。

圖4 羅氏分析儀和生物芯片掃描儀檢測(cè)樣本血清指標(biāo)含量相關(guān)性Fig. 4 The correlation between the Roche analyzer and the biochip scanner detection of serum index levels

羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀和近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片法檢測(cè)樣本血清4項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物含量的線性相關(guān)系數(shù)和線性回歸方程，如表2所示。

表2 兩儀器對(duì)樣本血清檢測(cè)結(jié)果的線性相關(guān)性Tab. 2 Linear correlation between the two instruments on the sample serum test results

由表2可知，利用生物芯片掃描儀近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片法檢測(cè)樣本血清的結(jié)果與羅氏電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀單指標(biāo)測(cè)量的結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.99，表明兩種檢測(cè)方法高度相關(guān)。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片的免疫反應(yīng)分析原理和生物芯片掃描儀的檢測(cè)原理，實(shí)現(xiàn)了近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合定量檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)對(duì)10例患者血清4項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，獲得多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果，CA125、CEA、CA19-9和AFP含量的檢測(cè)結(jié)果與羅氏電化學(xué)發(fā)光法單指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果比較，線性相關(guān)系數(shù)（R）分別為0.995、0.992、0.991、0.990，結(jié)果表明，二者具有高度相關(guān)性。因此，近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合定量檢測(cè)技術(shù)，不僅可一次性篩查多項(xiàng)癌癥，而且具有通量大、操作簡(jiǎn)單、樣本用量少、檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)大規(guī)模人群的檢測(cè)篩查具有重要的臨床意義。

由于腫瘤病變的復(fù)雜性，腫瘤標(biāo)志物與腫瘤之間的關(guān)系并非是一一對(duì)應(yīng)，而是多對(duì)多的關(guān)系[21-22]，即某一腫瘤對(duì)應(yīng)多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物或一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物對(duì)應(yīng)多個(gè)腫瘤。所以，選用特異性比較高的多個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合定量檢測(cè)，通過(guò)不同腫瘤標(biāo)志物的組合，可提高腫瘤篩查的特異性[23-26]。利用近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片的優(yōu)勢(shì)定期對(duì)健康人群進(jìn)行多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合定量檢測(cè)，對(duì)腫瘤的早期篩查具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[27-28]。

本文的近紅外熒光標(biāo)記蛋白芯片已通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局上海醫(yī)療器械檢測(cè)研究院的檢測(cè)，并取得相應(yīng)的檢測(cè)報(bào)告；生物芯片掃描儀已通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局浙江醫(yī)療器械檢測(cè)研究院的檢測(cè)，并取得相應(yīng)的檢測(cè)報(bào)告，目前二者均處于臨床試驗(yàn)階段。