程金元， 詹云妮， 黃 晨,2， 鄧擁軍,2， 房桂干,2*

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所;生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和 草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室,江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

隨著世界經(jīng)濟的不斷發(fā)展，社會對能源的需求越來越大，由此引發(fā)的能源短缺和環(huán)境污染等問題日趨嚴重，迫使人類尋求一種清潔、可再生的新型能源[1-3]。木質纖維生物質是地球上儲量最為豐富的可再生資源，利用木質纖維原料制備燃料乙醇是生物質能源轉化的重要方式，同時也是解決能源危機和環(huán)境污染問題的途徑之一[4]。木質纖維原料制備燃料乙醇主要包含預處理、酶水解和發(fā)酵等關鍵步驟。木質纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，其中半纖維素和木質素緊密包裹纖維素，形成制約纖維素發(fā)酵的天然屏障，使得纖維素難以被有效地發(fā)酵[5]，因此，對木質纖維生物質進行生物煉制，首先需要進行預處理。常用的預處理方法有物理法、化學法、生物法等，化學法是目前最為常用的預處理技術，通過化學藥劑處理木質纖維原料以實現(xiàn)木質纖維原料中纖維素、半纖維素、木質素等組分的有效分離，提高預處理底物的纖維素可及性，但化學法預處理存在反應溫度高、化學品回收難、污染嚴重等問題，限制了其大規(guī)模應用，亟需尋求一種清潔、可回收的預處理溶劑[6]。低共熔溶劑(DES)作為一種環(huán)保、價格低廉、易制備、熱穩(wěn)定性好、可循環(huán)使用的綠色溶劑，近年來逐漸成為研究熱點，其可以在較低溫度下有效實現(xiàn)纖維素、半纖維素、木質素的分離，大幅提高預處理物料發(fā)酵效率[7]。DES體系能夠與木質纖維素組分形成強分子間氫鍵作用，從而競爭木質纖維原料自身的氫鍵，實現(xiàn)木質纖維原料組分分離[8]。DES體系由氫鍵供體和氫鍵受體組成，其中氫鍵受體主要有氯化膽堿、脯氨酸、甜菜堿等;常用的氫鍵供體包括多元醇(乙二醇、甘油等)，有機酸(乳酸、草酸等)，氨基化合物(尿素、氨基酸等)和酚類化合物(香蘭素、對香豆酸等)等。近年來，科學界逐漸形成共識，即采用木質纖維原料來源的化合物(愈創(chuàng)木酚等)作為DES的氫鍵供體，可實現(xiàn)資源循環(huán)利用和可持續(xù)發(fā)展。生物基來源的乳酸、草酸等制備的DES體系對生物質預處理已有較好的效果，但在有機醇類(甘油、乙二醇等)及部分木質素衍生物類(香草醛、對羥基苯甲酸等)等供氫較弱的體系中，形成的DES對木質纖維原料的處理效果較差。本研究采用的氫鍵供體為愈創(chuàng)木酚，由于愈創(chuàng)木酚供氫能力弱，氯化膽堿和愈創(chuàng)木酚形成的DES體系對毛竹的預處理效果較差，向該DES體系中添加微量AlCl3,探討了AlCl3對DES體系的促進機制，以期為木質纖維素基DES體系的構建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛竹由浙江仙鶴紙業(yè)有限公司提供，毛竹的主要組成(質量分數(shù)計)：葡聚糖41.00%，木聚糖12.78%，木質素30.99%，乙醇抽出物1.12%。纖維素酶(諾維信CTec 2)和木聚糖酶(諾維信X 2753)均購于Sigma-Aldrich(上海)公司，實測酶活力分別為250 FPU/g和3 490 U/g。AlCl3、氯化膽堿和愈創(chuàng)木酚，均為市售分析純。

1.2 AlCl3輔助的低共熔溶劑預處理

毛竹竹片首先在自來水中浸泡過夜，浸泡后的竹片用雙螺桿擠壓機擠壓后，再用GNM300盤磨機進行盤磨處理，盤磨間隙為0.2 mm，盤磨得到的竹纖維長度約為0.5～2 mm，盤磨后的原料經(jīng)自然風干后測定水分并于密封袋中密封保存，備用。

AlCl3輔助的低共熔溶劑(DES)的制備在80 ℃油浴鍋中進行，DES總質量為100 g。按不同物質的量(n氯化膽堿∶n愈創(chuàng)木酚∶nAlCl3為25 ∶50 ∶1、 25 ∶50 ∶0.8、 25 ∶50 ∶0.4、 25 ∶50 ∶0.2和25 ∶50 ∶0)稱取氯化膽堿、愈創(chuàng)木酚和AlCl3至250 mL三角燒瓶中，于80 ℃油浴中不斷攪拌，直至體系為澄清、透明狀液體，經(jīng)換算溶劑體系中AlCl3用量(摩爾分數(shù)，下同)為1.32%、 1.06%、 0.53%、 0。

準確稱取相當于絕干10 g的風干毛竹(含水量10.24%)11.14 g于上述三角燒瓶中，將三口燒瓶轉入至110 ℃油浴鍋中攪拌反應1 h，反應結束后，將三角燒瓶從油浴鍋中取出，反應混合物倒入250 mL丙酮水溶液(體積比1 ∶1)中終止反應，然后置于磁力攪拌器上攪拌4 h，再采用布氏漏斗進行固液分離，所得預處理物料(固液分離后含纖維素的固形物)置于4 ℃冰箱中儲存、備用。

1.3 酶水解

稱取相當于絕干0.5 g預處理物料于150 mL酶解瓶中，加入0.1 mL吐溫80和0.04 mL 10 g/L四環(huán)素溶液，同時加入1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，調節(jié)體系pH值至4.8左右。分別按酶用量25 FPU/g(以葡聚糖質量計)和150 U/g(以木聚糖質量計)加入纖維素酶和木聚糖酶，并補充適量去離子水使反應體系體積為20 mL。將酶解瓶置于50 ℃和150 r/min的搖床中反應72 h。酶水解結束后，取1 mL酶解樣品沸水中高溫滅活3 min，而后于10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液測定其中的葡萄糖濃度。預處理物料葡聚糖酶水解得率按公式(1)計算：

yc=m1×0.9/m2×100%

(1)

式中：yc—葡聚糖酶水解得率，%；m1—水解液中葡萄糖質量，g；m2—酶水解初始底物中葡聚糖質量，g。

1.4 分析方法

1.4.1毛竹化學組分分析 實驗中物料葡聚糖、木聚糖和木質素(酸溶木質素和酸不溶木質素之和)質量分數(shù)均采用美國可再生能源實驗室的標準方法測定[9]。

1.4.2物料得率和化學組分回收率分析 物料得率和組分回收率按式(2)和式(3)計算：

y=m3/m4×100%

(2)

r=m5/m6×100%

(3)

式中:y—物料得率，%；m3—預處理后物料質量，g；m4—初始物料質量，g；r—化學組分回收率，%；m5—預處理后物料中剩余各組分質量，g；m6—初始物料中各組分質量，g。

1.4.3單糖含量的測定 葡萄糖和木糖等可發(fā)酵糖濃度均采用Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)測定，色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫55 ℃，進樣量10 μL；流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度35 ℃。

1.4.4X射線衍射(XRD)分析 實驗中樣品的結晶度采用Advanced D8 X射線衍射儀(德國布魯克公司)測定。儀器采用Cu Kα輻射源為X射線發(fā)射源，入射線波長為0.15 nm，測試過程中電壓40 kV，電流40 mA。X射線發(fā)生器功率為3 kW，衍射角度2θ為10°～40°，掃描速率為2(°)/min，樣品的結晶度按Segal提出的經(jīng)驗公式(4)計算。

ICr=(I002-Iam)/I002×100%

(4)

式中：I002—002晶格的極大衍射峰強度；Iam—無定形區(qū)背景衍射的散射峰強度。

1.4.5掃描電鏡(SEM)分析 掃描電鏡(SEM)分析前物料需進行冷凍干燥并用E-1010噴頭進行表面噴金處理20 s，物料經(jīng)噴金處理后采用3400-N掃描電鏡(日本Hitachi公司)進行分析，電壓為15 kV。

1.4.6紅外光譜(FT-IR)分析 DES預處理前后物料的(FT-IR)分析采用TENSOR27紅外光譜儀(德國布魯克公司)進行分析，掃描波數(shù)為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，每個樣本掃描32次。

2 結果與分析

2.1 預處理對毛竹化學組成及回收率的影響

采用供氫能力較弱的愈創(chuàng)木酚作為DES的氫供體，并加入微量AlCl3，實驗設置5個不同的AlCl3用量梯度。隨著AlCl3用量的增加，預處理后物料回收率、物料中各成分含量，以及預處理后物料葡聚糖、木聚糖回收率和木質素脫除率如表1所示。

表1 不同AlCl3用量低共熔溶劑預處理對竹材化學組分的影響Table 1 Effect of the different dosage of AlCl3 in DES on the content of the bamboo components

由表1可知，未添加AlCl3的DES中預處理物料回收率為95.10%，其中葡聚糖、木聚糖和木質素含量與毛竹原料相近，表明氯化膽堿/愈創(chuàng)木酚體系對毛竹預處理效果不顯著。隨著AlCl3的引入，預處理效率大幅上升，其中預處理物料得率從未添加AlCl3時的95.10%下降至57.16%，表明AlCl3用量的增加有利于竹材組分降解，具體表現(xiàn)為預處理物料葡聚糖、木聚糖、木質素含量發(fā)生不同程度的變化[9-10]，其中木聚糖和木質素質量分數(shù)分別從未添加AlCl3的12.58% 和28.87%降低到2.87%和13.62%，而葡聚糖的質量分數(shù)由42.31%增加到68.82%，表明隨著AlCl3用量的增加，毛竹中的木質素和半纖維素降解越來越劇烈，而葡聚糖則比較穩(wěn)定。在DES預處理體系中，未加入AlCl3的體系中形成的氫鍵較弱，不足以競爭木質纖維原料間的氫鍵；而AlCl3能夠與氯化膽堿、愈創(chuàng)木酚的DES形成氯離子-金屬陽離子-愈創(chuàng)木酚超分子配合物，增強了DES體系中的氫鍵作用，使木質纖維原料組分之間的氫鍵斷裂而發(fā)生分離[11]。

圖1 AlCl3用量對DES體系下 葡聚糖酶解率的影響Fig.1 Effect of AlCl3 dosage on glucan enzymatic hydrolysis yield in DES system

由表1可知，AlCl3用量為0.27%時，相較于未加入AlCl3的體系，木聚糖的回收率迅速降低，由93.65% 降低到31.29%，木質素脫除率迅速增加，由11.40%增加到54.39%，表明少量的AlCl3的加入可有效促進木聚糖和木質素的降解。隨著AlCl3用量的增加，木聚糖和木質素的降解越來越嚴重，當AlCl3用量為1.32%時，木聚糖脫除率和木質素脫除率達到最大值，分別為87.16% 和74.88%。而葡聚糖回收率隨著AlCl3用量的增加基本保持不變，始終在95%以上，表明本研究所用DES對纖維素的影響較小，表明氯化膽堿/愈創(chuàng)木酚/AlCl3體系能夠實現(xiàn)木聚糖和木質素的大量降解，并同時保留幾乎全部葡聚糖[12]。

2.2 預處理對酶解效果的影響

預處理物料的酶水解效率是評價預處理效果的關鍵指標，對不同AlCl3用量的DES預處理毛竹進行酶水解，并分析了酶水解得率與木聚糖和木質素脫除率的關系，結果如圖1和圖2所示。

由圖1可知，未添加AlCl3的DES預處理竹材葡聚糖酶水解得率較低，僅為11.16%。AlCl3的加入對低共熔溶劑體系有明顯促進作用，當添加少量AlCl3(用量為0.27%)，葡聚糖酶水解得率由11.16% 上升到68.37%，提高了57.21個百分點；隨著AlCl3用量的進一步增加，葡聚糖酶水解得率也隨之增加，當AlCl3用量為1.32%時，葡聚糖酶水解得率達到最大值96.20%，比未添加AlCl3的DES預處理毛竹增加了近8倍。葡聚糖酶水解得率的提高得益于預處理過程中木聚糖和木質素的去除，提高了纖維素的可及度。進一步研究了酶水解得率與木聚糖和木質素脫除率的關系，如圖2所示，酶水解得率與木聚糖和木質素的脫除率均有很強的線性關系，R2分別為0.98和0.99，表明毛竹中木聚糖和木質素的去除均對酶水解有較強促進作用。

圖2 木質素脫除率(a)和木聚糖脫除率(b)與酶水解得率的關系Fig.2 The relationship of lignin(a) and xylan(b) removal with the glucose enzymatic yield

2.3 預處理前后物料表征分析

2.3.1纖維素結晶度 為深入了解AlCl3的引入對DES預處理物料纖維結構的影響，測定了預處理前后物料纖維素結晶度，并比較了纖維素結晶度與葡聚糖酶水解得率的關系，結果如圖3和圖4所示。

圖3 不同AlCl3用量預處理物料的XRD圖 圖4 葡聚糖酶水解得率與纖維素結晶度的關系

由圖3及公式(4)經(jīng)計算可知，毛竹原料的纖維素結晶度為59.59%，預處理物料纖維素結晶度隨著AlCl3用量的提高而顯著增加。未加AlCl3的DES中預處理后毛竹的結晶度與原料相近，為58.99%。隨著AlCl3用量從0提高至1.32%，預處理物料纖維素結晶度從58.99%提高至61.31%、 61.91%、 62.83%和67.34%，這是因為在DES預處理過程中，非結晶態(tài)的木聚糖和木質素大量降解，使結晶區(qū)含量大幅增加[9]。由圖4得出，預處理后毛竹的結晶度和酶水解得率存在一定程度的正相關性，R2為0.60，表明DES預處理物料纖維素結晶度并非影響葡聚糖酶水解得率的主要因素。在本研究體系中，葡聚糖酶水解得率的提高主要受木質素和半纖維素的脫除的影響，這兩者的去除減少了其對纖維素的附著，增加了纖維素酶與纖維素的結合位點[13]。

2.3.2SEM分析 采用掃描電子顯微鏡觀察原料及不同的AlCl3用量下的低共熔溶劑預處理毛竹纖維的微觀結構，結果如圖5所示。

由圖5可知，原料毛竹的纖維較長，表面有少量分絲現(xiàn)象，可能是由于盤磨處理過程中的機械作用所致；與原料相似，未添加AlCl3的預處理物料纖維仍保持完整，并未發(fā)現(xiàn)明顯變化；當AlCl3用量為0.27% 時，預處理物料纖維明顯變短，并伴有纖維團聚現(xiàn)象[14-15]，這是因為纖維尺寸的變短以及木質素和半纖維素溶出使得纖維的比表面積增大，進而增加了纖維之間的氫鍵結合[16]。隨著AlCl3用量的繼續(xù)增加，纖維之間的團聚更加明顯，當AlCl3用量為0.53%、 1.06%和1.32%時，SEM圖已看不出單根纖維的存在。由SEM結果可以得出，預處理過程中毛竹切斷多，纖維的比表面積增大，酶解過程中的酶結合位點增多，增加了纖維素酶與纖維素的吸附，進而提高了酶解得率。

a.原料raw material; b.0; c.0.27%; d.0.53%; e.1.06%; f.1.32%圖5 不同AlCl3用量預處理物料的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of materials pretreated with different AlCl3 dosage

a.原料raw meterial; b.0; c.0.27%; d.0.53%; e.1.06%; f.1.32%圖6 不同AlCl3用量預處理物料FT-IR圖Fig.6 FT-IR spectra of materials pretreated with different AlCl3 dosage

經(jīng)過DES預處理的物料，其紅外譜圖(曲線b～f)中1422和1367 cm-1處無明顯變化，說明DES預處理過程纖維素的降解程度較小。隨著AlCl3用量的增加，纖維素結晶區(qū)1101 cm-1處信號峰增強，表明纖維素結晶度增加；LCC吸收峰(1730 cm-1)逐漸減小，并且當AlCl3用量為1.32%時，1730 cm-1處的吸收峰消失，表明半纖維素降解嚴重；木質素在1507、 1602和833 cm-1處相關峰隨著預處理強度不斷增加，其信號逐漸減弱，說明木質素逐漸降解；木質素的紫丁香基吸收峰(1320 cm-1)在整個預處理過程中無明顯變化，而愈創(chuàng)木基峰(1237 cm-1)則隨著AlCl3用量的增加，強度逐漸降低，表明愈創(chuàng)木基有一定程度的減少，說明隨著AlCl3用量的增加愈創(chuàng)木基在DES預處理過程中較紫丁香基更易于降解。

3 結 論

3.1DES氯化膽堿/愈創(chuàng)木酚體系對毛竹預處理無明顯作用，而AlCl3的引入能夠有效促進木聚糖和木質素降解，并能保留幾乎全部葡聚糖。當AlCl3的用量從0增加到1.32%，半纖維素回收率從93.65%降低到12.84%，木質素脫除率由11.40%增加到74.88%。

3.2隨著木聚糖和木質素的脫除，預處理物料酶水解性能大幅提高。未加AlCl3的DES預處理物料葡聚糖酶水解得率為11.16%；AlCl3的用量為1.32%時，預處理物料葡聚糖酶水解得率提高至96.20%，酶水解得率提高近8倍。

3.3經(jīng)XRD、FT-IR和SEM分析可知，纖維素結晶度并非影響葡聚糖酶水解得率的主要因素，而木質素和半纖維素的脫除對其酶解效果影響較大。隨著預處理強度的增加，纖維素含量增加，半纖維素和木質素含量減少，葡聚糖酶解得率和這兩者的脫除率呈較強的線性關系；當AlCl3的用量從0增加到1.32%，纖維的切斷逐漸增多，團聚現(xiàn)象顯著增強，纖維比表面積增大，纖維素與酶的結合位點增多，毛竹酶水解得率顯著增加。