蔡娟娟，黃 靜，蘇玲玲，徐儷穎

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)·浙江 杭州 310000；2寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院·浙江 寧波 315300；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院·浙江 杭州 310006)

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)是指因?yàn)檠ā⒅?、空氣等形成的栓子堵塞肺?dòng)脈系統(tǒng)，引發(fā)肺循環(huán)障礙從而影響呼吸功能，最終造成致命性危害的常見臨床疾病[1]。栓子阻礙血液可造成氧化應(yīng)激損傷，引起肺動(dòng)脈高壓，加之栓子可刺激血管內(nèi)皮，易引起炎癥反應(yīng)進(jìn)一步惡化病情。流行病學(xué)調(diào)查顯示，APE發(fā)病率隨年齡增加而增長(zhǎng)，尤其是高齡女性，>75歲的女性其發(fā)病率大于0.5%[2]。APE患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且無典型臨床特征，易被誤診、漏診，大部分患者死亡后才被確診，嚴(yán)重危害APE患者的生命安全。

目前，對(duì)于APE臨床上常采用抗凝、溶栓等治療方法，治療效果尚佳，但仍有出血等風(fēng)險(xiǎn)。黃芩苷是中藥黃芩的主要活性成分，黃苓味苦、性寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，臨床應(yīng)用廣泛。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，以黃芩為君藥的復(fù)方制劑已達(dá)477種[3]。黃芩苷具有多種藥理作用，在清除自由基、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、保護(hù)缺血再灌注損傷心肌和大腦等方面均具有良好效果[4]。黃芩苷可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活改善大腸桿菌誘導(dǎo)的急性肺損傷，降低肺組織Wet/Dry ratio和MPO活性以及IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5]。雖然有報(bào)道稱黃芩苷在預(yù)防急性肺損傷方面有相應(yīng)效果，但在預(yù)防急性肺栓塞中的作用研究甚少[6]。本研究旨在探討分析黃芩苷對(duì)自體血栓栓塞致APE大鼠的影響和對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體質(zhì)量(250±20)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0015，上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠均采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，環(huán)境恒溫，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%，光照每12 h明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h。由浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)SYXK(浙)2021-0033。

1.2 藥物及試劑 黃芩苷(CY11274)：北京凱瑞基。超氧化物歧化酶(SOD，IC-SOD-Ra)試劑盒、髓過氧化物酶(MPO，IC-MPO-p)試劑盒、丙二醛(MDA，IC-MDA-Ge)試劑盒：IC/IBL；NF-κB p65(D14E12)、p-NF-κBp65(Ser536)(93H1)、IκBα(L35A5)、p-IκBα(Ser32/Ser36)：美國(guó)CST。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Micro17R低溫高速離心機(jī)：Thermo Fisher Scientific；AE2000顯微鏡：Microscopy Solutions by Motic；Tanon-1600凝膠成像儀、VE180C電泳槽、VE186轉(zhuǎn)膜儀：天能集團(tuán)；610020-9Q化學(xué)發(fā)光儀：上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組、APE模型制備及給藥 60只SD大鼠隨機(jī)分為Sham組、APE組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組，每組各12只。酒精鼠尾消毒后，頭皮針(內(nèi)徑1.1 mm)尾靜脈取血，待血液凝固后，在70 ℃的水浴鍋中水浴10 min制成血栓栓子(1.1 mm×2 mm)，生理鹽水清洗3遍后置于試管中，然后加入2 mL生理鹽水，4 ℃冷藏備用。仰臥固定大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，左頸部剪毛并進(jìn)行消毒，行縱切口，暴露頸外靜脈，在肺動(dòng)脈中插入導(dǎo)管針，注入30個(gè)血栓栓子+2 mL生理鹽水后縫合傷口。Sham組不注入血栓栓子，僅注入等量生理鹽水，其余操作同上。黃芩苷低劑量組：皮下注射1 mg/kg黃芩苷；黃芩苷中劑量組：皮下注射2 mg/kg；黃芩苷高劑量組：皮下注射4 mg/kg黃芩苷；Sham組：皮下注射等量DMSO；APE組：皮下注射等量DMSO；均在造模前2 h注射[7]。

2.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定

2.2.1 肺動(dòng)脈壓(mPAP)、右心室壓力(RVP)測(cè)定 各組大鼠血栓輸入4 h后，2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射，各組大鼠麻醉后，分離右側(cè)頸外靜脈，插入聚苯乙稀管(0.9 mm)，依次經(jīng)過右心房、右心室、肺動(dòng)脈，測(cè)定并記錄各組大鼠的RVP和mPAP。

2.2.2 血?dú)夥治?處死大鼠前采用頸動(dòng)脈插管，取5 mL血放入抗凝管中，注意密封，全自動(dòng)血?dú)夥治鰴C(jī)對(duì)各組大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治觯謩e監(jiān)測(cè)氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)。

2.2.3 肺濕干重比(Wet/Dry ratio)及肺臟病理觀察 處死大鼠后，取右肺組織稱重后，在80 ℃恒溫烘箱中干燥24 h，再進(jìn)行稱重，兩次重量比為Wet/Dry ratio，可用來評(píng)價(jià)肺組織水腫情況。取大鼠左側(cè)肺組織采用生理鹽水沖洗，置于10%甲醛固定，常規(guī)制備5 μm切片。采用HE染色并進(jìn)行顯微鏡觀察。剩余左肺組織，液氮冷凍，以備后續(xù)檢測(cè)分析。

2.2.4 肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 依據(jù)試劑盒說明按步驟測(cè)定肺組織SOD、MPO的活性及MDA含量。

2.2.5 WB檢測(cè)肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65I、Iκ-Bα、p-IκBα蛋白的表達(dá) 取肺組織，RIPA裂解液裂解提取總蛋白，肺組織蛋白濃度用BCA法測(cè)定；隨后取適量樣本，5% SDS-PAGE分離膠中電泳(80 V)，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜；將膜置于5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床振蕩1.5～2 h后采用TBST洗滌3次，將膜放入一抗稀釋液(anti-NF-κBp65、p-NF-κBp65I、κ-Bα、p-IκBα)的孵育盒中4 ℃震蕩過夜，然后加入相應(yīng)二抗孵育2 h，結(jié)束后TBST洗膜3次；化學(xué)發(fā)光、顯影、定影；掃描膠片，用chemi capture軟件對(duì)蛋白條帶定量分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠mPAP、RVP、動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠mPAP、RVP、PaO2、PaCO2比較

3.2 各組大鼠肺組織Wet/Dry ratio結(jié)果分析 見表2。

表2 各組大鼠肺組織Wet/Dry ratio結(jié)果的比較

3.3 各組大鼠肺臟病理觀察結(jié)果 肺組織HE染色結(jié)果顯示：Sham組大鼠肺組織未見明顯病理性變化；APE組大鼠肺組織呈一定病理學(xué)損傷，肺細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則狀，肺泡內(nèi)和間質(zhì)水腫出血并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黃芩苷處理組大鼠肺組織與APE組相比，肺組織病理性損傷程度有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理檢測(cè)結(jié)果(HE，×400)

3.4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表3。

表3 各組大鼠肺組織SOD、MPO活性及MDA含量的比較

3.5 各組大鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65、IκBα、p-IκBα蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果與Sham組比較，APE組肺組織p-IκBα蛋白表達(dá)明顯降低P<0.01)，NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，IκBα蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)；與APE組比較，黃芩苷低劑量組NF-κBp65、IκBα、p-IκBα、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)未發(fā)生變化(P>0.05)，黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組p-NF-κBp65蛋白的表達(dá)顯著減少(P<0.05或P<0.01)，p-IκBα蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)，NF-κBp65、IκBα蛋白的表達(dá)水平變化不明顯(P>0.05)。見圖2。

注：與APE組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4 討論

APE發(fā)病率較高，在心血管疾病的發(fā)病率中高居第三，僅低于動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓，常表現(xiàn)為血栓栓塞，占90%以上[8]。APE患者臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易被忽略，主要有呼吸困難急促、胸痛、昏厥、咯血等癥狀，與患者栓塞部位、栓子數(shù)量、大小以及自身有無基礎(chǔ)性心、肺疾病等有關(guān)[9]。早期研究提出[10],由肺血栓致APE的基本要素包括血流淤滯、血液高度凝集以及血管壁損傷三大因素；隨著進(jìn)一步研究表明，APE可由多種因素引起。發(fā)生APE時(shí)機(jī)體主要病理改變包括氣體交換功能和肺部血液動(dòng)力學(xué)的變化，肺栓塞處流量下降，肺動(dòng)脈壓增加，無效腔擴(kuò)大，肺內(nèi)血流分布變化，通氣/血流比例失調(diào)，氣體交換功能正常運(yùn)行；進(jìn)一步釋放血管收縮物質(zhì)等致支氣管痙攣，破壞肺泡表面活性物質(zhì)，進(jìn)一步造成肺不張，肺血管阻力上升；肺動(dòng)脈壓力升高以及右室后負(fù)荷驟然增加，可增高右室壁壓力，致右心擴(kuò)張甚至衰竭[11]。

目前，臨床上APE的治療主要以抗凝溶栓為主，治療效果較為滿意，但存在出血等問題。黃芩苷是黃芩根部提取而來的產(chǎn)物，為黃酮類化合物，具有顯著的抗炎抑菌、清除氧自由基、抗變態(tài)反應(yīng)等作用，被廣泛應(yīng)用于臨床心血管疾病的救治[12]。黃芩苷可清除羥、烷自由基，進(jìn)而抑制由此導(dǎo)致的卵磷脂質(zhì)體代謝和線粒體脂質(zhì)過氧化，減輕H2O2造成的細(xì)胞損傷，具有保護(hù)心肌缺血作用[13]。Caspase-3是NF-κB的下游調(diào)控因子，參與肺細(xì)胞凋亡途徑，黃芩苷可通過抑制NF-κB釋放，減少Caspase-3、8活化以及減輕線粒體腫脹，保護(hù)受損肺組織，發(fā)揮抑制肺細(xì)胞凋亡作用[14]。

本研究使用自體血栓栓塞建立APE大鼠模型，實(shí)驗(yàn)過程中采用改良的經(jīng)頸靜脈栓塞法，栓子穩(wěn)定，可控性強(qiáng)，可有效確保大鼠模型的均一性[15]。本研究結(jié)果顯示黃芩苷高劑量組mPAP、RVP水平顯著低于APE組(P<0.05)，提示高劑量的黃芩苷可降低APE大鼠mPAP、RVP水平，有效改善肺動(dòng)脈高壓癥狀。APE患者常伴有低氧血癥，PaO2降低是其主要癥狀，臨床上PaO2、PaCO2水平可作為檢測(cè)APE的判斷依據(jù)。本研究中黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組PaO2水平高于APE組(P<0.05)，說明給予一定劑量的黃芩苷可升高APE大鼠的PaO2，改善其通氣/血流比例，可有效糾正機(jī)體缺氧狀態(tài)，促進(jìn)氣體交換功能的恢復(fù)；而各組大鼠間PaCO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明給予黃芩苷治療不會(huì)引起CO2嚴(yán)重潴留。

各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示，APE組大鼠肺組織呈一定病理學(xué)損傷，肺細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則狀，肺泡和肺泡間質(zhì)水腫、出血以及伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而黃芩苷組大鼠肺組織與APE組相比，肺組織病理性損傷程度有所改善，提示黃芩苷可在一定程度上改善肺組織損傷。本研究中APE+黃芩苷高劑量組Wet/Dry ratio低于APE組(P<0.05)，說明給予高劑量的黃芩苷，可有效緩解肺組織水腫癥狀?？梢酝ㄟ^監(jiān)測(cè)MDA可反映脂質(zhì)過氧化程度，監(jiān)測(cè)SOD活性水平以反應(yīng)心肌抗脂質(zhì)過氧化能力；MPO是一種可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的紅血素蛋白，可以通過監(jiān)測(cè)其含量來觀察組織過氧化損傷程度[16]。發(fā)生APE時(shí)，肺動(dòng)脈壁、肺組織均存有炎癥反應(yīng)，與內(nèi)膜增生、血栓溶解有關(guān)，在本次實(shí)驗(yàn)中黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組MPO活性水平及MDA含量都明顯下降(P<0.05或P<0.01)，黃芩苷高劑量組SOD活性水平明顯上升(P<0.01)，說明高劑量黃芩苷可增加機(jī)體抗氧化能力，抑制炎癥反應(yīng)。

NF-κB升高與肺部炎癥反應(yīng)有關(guān)，可加重肺組織損傷，NF-κB在哺乳動(dòng)物中有五種亞型，可相互作用調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)；IκB激酶復(fù)合物(IKK)是NF-κB最經(jīng)典的激活途徑，炎癥因子刺激細(xì)胞后將其活化，IκB蛋白磷酸化后再泛素化修飾，后被降解為NF-κB二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，和特定序列相結(jié)合，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[17]。本研究中，黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組肺組織中p-NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平極顯著下降(P<0.05或P<0.01)，p-IκBα蛋白表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)，NF-κBp65、IκBα蛋白的表達(dá)水平均無顯著變化(P>0.05)；提示一定劑量的黃芩苷可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路和p-NF-κBp65蛋白表達(dá)水平，上調(diào)p-IκBα蛋白水平，進(jìn)一步保護(hù)受損肺組織。

綜上所述，黃芩苷抑制NF-κB信號(hào)通路，使p-IκBα蛋白表達(dá)水平上調(diào)，使p-NF-κBp65蛋白表達(dá)下調(diào)，劑量依賴性改善血栓栓塞致APE大鼠的mPAP、RVP水平，提高PaO2，改善肺組織損傷程度，調(diào)高機(jī)體抗氧化能力，對(duì)受損肺組織起到保護(hù)作用。