李新寧 林秀峰 鄭湘瓊 杜靜 李潔亮 程立子

隨著生育政策的改變以及女性生育年齡的推遲，卵巢低反應（poor ovarian response，POR）的發(fā)生率有上升的趨勢，具體表現(xiàn)為竇卵泡計數少，對外源性促性腺激素反應低下，促性腺激素用量大，排卵少，和（或）卵子質量差，最終導致所獲胚胎質量差、臨床妊娠率低及妊娠丟失率高等。在診治過程中，為改善此類患者的妊娠結局，臨床醫(yī)生一直在探尋著可行的方法，其中在控制性超促排卵過程中予以添加輔助治療為最受關注的方向，自2000年Casson等[1]首次報道脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）可改善卵巢低反應患者妊娠結局以來，后續(xù)的研究關于DHEA能否改善POR患者的妊娠結局提供了有爭議的結論，且目前關于DHEA添加后卵泡微環(huán)境的變化尚未明確，因此，本研究目的在于探討DHEA對接受體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的博洛尼亞標準下的POR人群的卵巢反應性及臨床結局的影響，以及通過分析卵泡液成分探討DHEA對于卵泡微環(huán)境的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月—2019年8月于中山市博愛醫(yī)院生殖中心（筆者所在醫(yī)院）接受治療的POR患者85例。根據制定的博洛尼亞（Bologna）標準[2]，POR人群需滿足以下至少兩個條件：（1）具有卵巢儲備功能降低的高危因素，如高齡（≥40歲）或任何其他POR危險因素；（2）先前的POR史；（3）雙側卵巢基礎竇卵泡數（antral follicle count，AFC）＜7個或抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）＜1.1 ng/mL等卵巢儲備功能異常指標?；蜻B續(xù)兩個大劑量卵巢刺激方案周期仍出現(xiàn)POR的患者。排除標準：（1）存在不適宜妊娠的禁忌證的內外科合并癥；（2）有化療、盆腔放射史及卵巢手術史；（3）有黏膜下肌瘤、宮腔粘連、子宮畸形等子宮異常因素；（4）男方存在嚴重的精液異常：如少精甚者無精；（5）夫妻雙方至少一方存在染色體異常。研究經醫(yī)院倫理委員會批準。將符合標準且同意試驗的POR患者，隨機分為用藥組（n=41）和對照組（n=44），兩組患者年齡、BMI、基礎激素水平、竇卵泡數差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明兩組患者卵巢儲備具有可比性，詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較（x- ±s）

1.2 治療方法及檢測指標

兩組行促排前均于月經第3天晨起空腹檢測血清性激素基礎水平：包括卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（estradiol，E2）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）水平以及AMH水平，并行經陰道B超計數AFC。用藥組予DHEA（GNC，美國）25 mg/次，每天3次，12周。對照組直接進入周期。兩組均使用拮抗劑方案，重組促卵泡素（果那芬，瑞士默克雪蘭諾）進行促排卵，第5天開始加用拮抗劑（西曲瑞克，瑞士默克雪蘭諾）0.25 mg/d。定期性陰道超聲監(jiān)測卵泡生長并根據患者情況調整促性腺激素用量。扳機時機為雙側卵巢內直徑＞18 mm的卵泡不少于2個時，扳機藥物為人絨毛膜促性腺激素250μg（艾澤，瑞士默克雪蘭諾）。扳機后36 h左右取卵。根據精液情況，采用體外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞漿內單精子顯微注射技術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）即受精。取卵后3 d行胚胎移植，移植后予黃體支持。對于有多個胚胎且首次移植不成功者，采用玻璃化冷凍進行解凍周期移植直至妊娠或胚胎用盡，計算累計活產率 。新鮮周期（取卵周期內移植未經冷凍的胚胎）臨床妊娠率指臨床妊娠次數/移植周期數×100%。

1.3 樣本收集及檢測

1.3.1 卵泡液收集 選擇取卵日穿刺的第1個直徑＞16 mm的卵泡，為去除卵泡液中有形成份，將拾卵后的卵泡液置于離心機中，離心機轉速為3 000 r/min，離心時間為10 min，將離心后的上清液密封保存于-80℃冰箱中。

1.3.2 檢測 卵泡液中的AMH、DHEA-s、IGF-1采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）進行檢測。生長分化因子-9（growth differentiation factor-9，GDF-9）的蛋白含量采用Western blotting方法測定。

1.3.3 妊娠判斷標準 進行常規(guī)IVF或ICSI授精（根據男方精液情況決定），是否進行新鮮周期移植取決于患者有無存在影響移植的因素如存在子宮內膜不均、孕酮過高等。若新鮮周期移植，于取卵后第3天移植1～2個第3天（D3）胚胎，于取卵后5 d移植囊胚1枚，并予黃體支持。若為解凍周期移植，則等待移植的影響因素消除后擇期行凍融胚胎移植（frozen embryo transfer，F(xiàn)ET）。移植后14 d，檢測血β-HCG＞25 U/L診斷為生化妊娠。超聲見妊娠囊、卵黃囊為臨床妊娠。累計活產率=獲得活產的患者數/1次COS患者數×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數據均采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料表示為 （x-±s），采用t檢驗，若不符合正態(tài)分布，表示為 [M（P25，P75）]，檢驗方法為Mann-Whitney U檢驗；計數資料表示為（n，%），采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對照組與用藥組患者促排卵情況及臨床結局比較

用藥組促性腺激素總量少于對照組[（2 498.13±747.13）U vs . （2 322.08±792.72）U]，用藥組平均獲卵數、卵裂數、平均可利用胚胎數均較對照組多，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同時HCG日血清FSH、E2、子宮內膜厚度等差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。新鮮周期移植用藥組20例（臨床妊娠5例，妊娠率25.00%），對照組15例（臨床妊娠5例，妊娠率33.33%），組間差異采用卡方檢驗，P＞0.05，其余因HCG日孕酮升高行全胚冷凍。累計活產率用藥組高于對照（29.55% vs.34.15%），但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2和表3。

表2 卵巢反應性及妊娠結局的比較

表3 HCG日內膜厚度及激素水平比較

2.2 卵泡液指標比較

兩組患者卵泡液AMH、DHEA-s、IGF-1、GDF-9測定差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。如表4。

表4 卵泡液指標

3 討論

隨著受教育水平提高、社會壓力的增加，生育年齡呈現(xiàn)逐漸延后趨勢，特別是隨著“三孩”政策落地，面臨生育難題的高齡女性越來越多，其中卵巢低反應是導致這些女性接受輔助生殖技術治療臨床結局不理想的主要原因。成功分娩一個健康活嬰是輔助生殖技術的終極目標，而獲取的卵子數量以及質量對妊娠結局有直接影響。獲卵數量是POR患者妊娠結局的決定性因素，如何改善低儲備患者的卵巢反應性長久以來都是研究的熱點。在研究中，筆者觀察了POR患者IVF周期前使用DHEA預處理與否，對IVF周期結局以及對卵泡液中AMH、IGF1以及GDF9的表達影響。筆者觀察到與對照組相比，DHEA組有更高的獲卵數以及受精數，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），同時兩組間妊娠結局差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

普遍認為DHEA是通過轉化為雄激素發(fā)揮作用的，雄激素是調控卵子發(fā)育的重要因素[2-3]，補充雄激素可改善POR患者臨床結局[4-5]，DHEA是雄激素合成的前體，僅有較弱的激動雄激素受體作用且可在卵泡轉化為目標激素發(fā)揮作用。因此，DHEA是理想的雄激素替代藥物。2000年Casson等[1]首次發(fā)現(xiàn)DHEA能提高卵巢反應性。但隨后的研究就DHEA能否改善卵巢反應存在爭議[6-7]。一Meta分析指出，DHEA對提高獲卵無益[8-9]，但可改善卵子質量來提高妊娠率[10]，可能與DHEA 可以改善線粒體功能有關[11]。而另一研究[12]認為不能改善卵母細胞質量。在一項Cochrane系統(tǒng)評價中發(fā)現(xiàn)去除偏倚因素后DHEA的作用不再具有顯著性[13]。另一研究和本研究一致[14]，未能觀察到DHEA改善POR的臨床結局。

伏靜等[15]研究中DHEA處理后卵泡液DHEA-s增高。在另一研究[16]中，卵泡內DHEA-s雖升高，但其代謝產物并無增加。DHEA轉化為雄激素需要不同酶的參與，本研究中DHEA-s水平無增加，可能是其卵泡內與激素代謝相關的酶存在缺陷所致。

關于卵子的發(fā)生發(fā)育機制尚未明確，目前認為卵泡的生長及成熟受多種內分泌及旁分泌信號調控，特別是卵泡微環(huán)境中的AMH、IGF-1以及GDF-9等。AMH僅由顆粒細胞分泌，DHEA處理12周后，觀察到與先前的試驗一致的結果，即DHEA不能提高POR患者的AMH水平[17-18]，筆者認為這是由于POR患者卵巢儲備處于嚴重耗盡的極端，而卵巢儲備自出生那一刻已經被決定，DHEA并不能使其儲備增加[19]。GDF-9協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15參與卵泡發(fā)育和成熟[20-22]。即使在卵巢反應有所改善的研究中，GDF-9表達也無明顯增加[23]。因此，DHEA不通過GDF-9影響卵子發(fā)育。IGF-1對保持卵泡正常功能有重要作用[24]。IGF-1可提高原始卵泡對FSH的敏感性來增加卵泡反應性[25]。然而，本研究沒有發(fā)現(xiàn)兩組之間卵泡IGF-1水平有任何差異。因此DHEA考慮不能增加IGF-1的表達而影響卵子發(fā)育。

文章亮點在于：（1）在以往研究的基礎上通過收集卵泡液樣本分析DHEA療效。（2）本研究以前瞻性方式進行，以確保研究組與對照組的一致性和可比性。研究的局限性：（1）本研究為隨機對照研究，無法獲得分到DHEA組患者治療前的卵泡液樣本，但兩組患者的一般情況及卵巢儲備情況差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。（2）由于POR因生育時間有限而不愿意接受安慰劑治療，因此這不是安慰劑對照試驗。

本研究中，POR女性通過12周DHEA處理后，卵巢反應性、妊娠結局上并無明顯改善。同時，卵泡液中AMH、IGF-1、GDF-9含量也無顯著增加。鑒于目前對于DHEA能否使POR女性獲益仍存在爭議，盡管本試驗存在一定的局限性，但也能為將來研究DHEA對于POR女性的作用機制提供參考。對于DHEA的療效以及作用機制仍需大樣本、多中心的隨機對照研究以及基礎研究來進一步闡明。