范露，李嬋娟，闕鳳，董夢(mèng)瑩

(1.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，武漢 430205；2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068)

香精、香料的應(yīng)用非常廣泛，特別是在食品加工、化妝品研發(fā)、化工和制藥工業(yè)等方面都是必不可少的[1]。目前天然香精、香料的獲得方法主要有以下幾個(gè)方面：從植物中直接提取，培養(yǎng)植物細(xì)胞進(jìn)一步提取，酶合成法以及通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)獲得[2]。其中，通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)獲取這一方法最受人們的關(guān)注，因?yàn)槲⑸锬芨咝Ю锰烊辉线M(jìn)行催化合成大量的天然香料產(chǎn)物[3]。而想要利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)天然香精、香料，最關(guān)鍵的問(wèn)題就在于首先要獲得一株生產(chǎn)性能良好的菌株[4]。微生物可通過(guò)直接生物合成和生物轉(zhuǎn)化兩種途徑發(fā)酵合成各種天然香氣成分，而真菌是合成生產(chǎn)天然揮發(fā)性香氣物質(zhì)的重要資源之一[5-6]。

產(chǎn)香微生物在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛，如在煙用香料[7]、白酒[8]、茶葉[9]、饅頭[10]、泡菜[11]、醬油[12]、醋[13]、豆瓣醬[14]、發(fā)酵辣椒[15]等產(chǎn)品中應(yīng)用較多，采用微生物發(fā)酵法獲得香味成分具有產(chǎn)香菌生長(zhǎng)迅速且易于進(jìn)行基因工程改造優(yōu)化等優(yōu)點(diǎn),受到越來(lái)越多的重視和開(kāi)發(fā)，而這些研究的關(guān)鍵在于獲得生產(chǎn)性能好的菌株，因此對(duì)于產(chǎn)香功能性微生物的篩選鑒定、致香成分分析等研究具有較高的理論和應(yīng)用價(jià)值，為其應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步拓寬提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

土豆：市售；菌株3-7、5-3、5-8：由本實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中分離保存；瓊脂糖、TAE、蝸牛酶、蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、PCR試劑：均為生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；真菌DNA提取試劑盒、上樣緩沖液、λ-DNA-Hind Ⅲ Marker和溴化乙錠：中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DNR Bio-Imaging Systems B1S910型凝膠成像儀；Agilent 7890B-7000C型氣質(zhì)聯(lián)用儀；SPX-430型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；10-B7579型滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)鑒定

將3株菌株分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)上，用封口膜進(jìn)行密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)。同時(shí)分別取每株菌株1 mL的菌液加到2 mL的離心管中，再向離心管中加入500 μL的甘油，在121 ℃的條件下滅菌20 min進(jìn)行甘油保菌，便于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。每天在固定時(shí)間段測(cè)量菌落半徑。用接種針在菌落上挑取部分菌體，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.2 分子鑒定

將3株菌株接種到含有10 mL的酵母膏葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中，于28 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。用移液槍和1 mL的離心管小心地吸取在50 mL離心管底部的菌體，每次吸取體積為1 mL，放入1.5 mL的離心管中。將含有菌體的離心管放入離心機(jī)中在12000 r/min的條件下離心1 min。小心吸取上清部分，盡量將培養(yǎng)基全部吸出。重復(fù)以上步驟3次，再取100 μL濃度為0.2 mg/mL的蝸牛酶加入離心管中，為了防止蝸牛酶降解，再加入10 μL濃度為0.05 g/mL的EDTA。將加入上述試劑的離心管置于45 ℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h。將提取到的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像儀觀察判定DNA提取是否成功。將擴(kuò)增后DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)在凝膠成像儀下判定是否擴(kuò)增成功，成功擴(kuò)增后將得到的DNA進(jìn)行BLAST分析。

1.3.3 發(fā)酵揮發(fā)性成分萃取及鑒定

采用頂空萃取揮發(fā)性成分后進(jìn)行GC-MS分析，同時(shí)以不接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。色譜條件：色譜柱DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度300 ℃，分流比50∶1，進(jìn)樣量1 μL，初始溫度35 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持0 min，以20 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：EI離子源，傳輸線溫度300 ℃，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃。采用面積歸一化法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)鑒定

菌株3-7在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)見(jiàn)圖1。

(1)培養(yǎng)1 d (2)培養(yǎng)5 d (3)鏡檢(1000×)

由圖1可知，28 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d后，菌落直徑可達(dá)70～74 mm，菌絲密集，呈絨毛狀向四周蔓延，邊緣均勻，表面不光滑，中間有凸起，菌絲呈白色；顯微鏡下可以觀察出為有隔菌絲；分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，分生孢子頭呈掃把狀，分生孢子直徑約為3 μm。

菌株5-3在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)見(jiàn)圖2。

(1)培養(yǎng)1 d (2)培養(yǎng)5 d (3)鏡檢(400×)

由圖2可知，28 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d后，菌落直徑可達(dá)8～10 mm，表面平滑，邊緣光滑，菌落為乳白色，顏色均一，表面濕潤(rùn)有光澤，黏稠易挑起；菌體呈卵圓形；繁殖方式為多邊出芽，細(xì)胞直徑約為3 μm。

菌株5-8在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)見(jiàn)圖3。

(1)培養(yǎng)1 d (2)培養(yǎng)5 d (3)鏡檢(1000×)

由圖3可知，28 ℃的培養(yǎng)條件下恒溫培養(yǎng)3 d后，菌落直徑可達(dá)69～72 mm，菌絲密集，呈絨毛狀向四周蔓延，邊緣均勻，表面不光滑，中間有凸起，菌絲呈白色；顯微鏡下可以觀察出為有隔菌絲；分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，分生孢子頭呈掃把狀，分生孢子直徑約為3 μm。

2.1.2 分子鑒定

按照真菌DNA提取試劑盒上的操作步驟進(jìn)行DNA的提取后，為了驗(yàn)證是否成功提取到DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳結(jié)果在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察，所得結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 DNA電泳結(jié)果Fig.4 The results of DNA electrophoresis

由圖4可觀察到拖帶現(xiàn)象，分析原因可能是含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，但也可以判斷出成功提取到菌株的DNA。將成功提取得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為了驗(yàn)證是否擴(kuò)增成功進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳結(jié)果在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察，所得結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 PCR電泳結(jié)果Fig.5 The results of PCR electrophoresis

由圖5可清楚地觀察到PCR擴(kuò)增結(jié)果較為成功，但條帶看起來(lái)稍有不清晰，可能的原因：一是染色時(shí)間不夠長(zhǎng)，二是染色液濃度較低。

將3株菌株的ITS基因序列通過(guò)與NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對(duì)序列相似性進(jìn)行分析比較，所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3株菌ITS基因序列與NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對(duì)序列相似性分析結(jié)果Table 1 The results of similarity analysis of sequence by ITS gene sequence and NCBI BLAST retrieval system of three strains

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，菌株3-7、5-8的ITS序列與GenBank中的JQ668740.1序列相似程度最高(相似度為96.10%)，這兩株菌初步鑒定為白地霉(Galactomycesgeotrichum)。菌株5-3的ITS序列與GenBank中的NR_153279.1相似程度最高(相似度為100%)，初步鑒定為卡氏念珠菌(Candidacabralensis)，屬于假絲酵母屬。

2.2 菌株發(fā)酵揮發(fā)性成分分析

將試管斜面菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)3 d，然后采用頂空萃取揮發(fā)性成分后進(jìn)行GC-MS分析，同時(shí)以不接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各菌株主要揮發(fā)性成分Table 2 The main volatile components of each strain

續(xù) 表

由表2可知，相對(duì)含量大于0.1%和匹配度大于80%的成分，各菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物成分總數(shù)和種類均有所不同。菌株5-3經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，相較于空白對(duì)照，主要新產(chǎn)生了異丁醇、異戊醇、2,4-二甲基戊烷、N-甲基-N-亞硝基苯胺和苯乙醇等幾種成分，其中尤以苯乙醇(相對(duì)含量7.07%)和異戊醇(相對(duì)含量3.06%)居多，說(shuō)明菌株5-3是一株代謝產(chǎn)醇能力較強(qiáng)的酵母，并且結(jié)合感官判斷，發(fā)酵產(chǎn)物醇香清新且不刺鼻，聞之非常愉悅；菌株3-7(5-8)代謝后產(chǎn)生了戊酸丁酯、丁酸戊酯、正戊酸正戊酯和苯乙醇等揮發(fā)性成分，其中以戊酸丁酯(相對(duì)含量2.06%)和苯乙醇(相對(duì)含量2.48%)為主，該菌株代謝過(guò)程中能產(chǎn)生酯類和醇類等揮發(fā)性成分，具有一定的產(chǎn)香能力。菌株代謝產(chǎn)生香氣成分與培養(yǎng)基的成分也存在密切關(guān)系，后續(xù)可作進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文對(duì)3株產(chǎn)香菌株進(jìn)行了形態(tài)鑒定和分子鑒定。通過(guò)菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)，所觀察到的形態(tài)可以初步判定其中3-7和5-8為霉菌，5-3為酵母菌。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確判定3株菌株的菌種類型，分別對(duì)3株菌株進(jìn)行DNA的提取，再進(jìn)行BLAST分析。根據(jù)BLAST分析所得到的結(jié)果可以判定3-7和5-8為同一種菌株，為一株白地霉菌，菌株5-3為假絲酵母。GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，菌株5-3是一株代謝產(chǎn)醇能力較強(qiáng)的酵母，發(fā)酵產(chǎn)物醇香愉悅；菌株3-7(5-8)代謝能產(chǎn)生一定量的酯類和醇類，具有一定的產(chǎn)香能力。該菌株在微生物發(fā)酵法來(lái)制取天然香精、香料方面有一定應(yīng)用潛力。