譚艷妮，施法，李欣蔚，李勇，張健，孫佳星，韓世寧，劉宏生

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，沈陽(yáng) 110036；2.沈陽(yáng)市市場(chǎng)監(jiān)管事務(wù)服務(wù)與行政執(zhí)法中心，沈陽(yáng)食品藥品檢驗(yàn)所，沈陽(yáng) 110136；3.遼寧省糧食科學(xué)研究所，沈陽(yáng) 110032；4.遼寧省生物大分子模擬計(jì)算與信息處理工程研究中心，沈陽(yáng) 110036)

調(diào)味面制食品，俗稱“辣條”、“面筋”、“素牛筋”，主要消費(fèi)群體是青少年兒童，特別是中小學(xué)生[1]，年銷(xiāo)售額可高達(dá)500億元。它的主要原料是小麥粉，經(jīng)配料食鹽、食糖、麻辣香辛料以及食品添加劑，通過(guò)食品加工機(jī)械擠壓、膨脹、蒸煮、成型、調(diào)味、包裝等工藝后制成的一種常見(jiàn)的即食方便食品[2-3]。據(jù)悉，2015年5月國(guó)家食藥監(jiān)總局發(fā)布了關(guān)于嚴(yán)格加強(qiáng)調(diào)味面制品等休閑食品監(jiān)管工作的通知。總局通過(guò)組織專項(xiàng)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，調(diào)味面制品普遍存在食品添加劑超范圍、超限量使用，微生物指示菌菌落總數(shù)也極易超高超標(biāo)[4-5]。

長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)的微生物菌群多樣性研究主要面臨耗時(shí)長(zhǎng)、分離鑒定工作量較大等問(wèn)題[6-8]，還有某些特定種群的微生物無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)的手段分離純化并培養(yǎng)出來(lái)[9]，令研究成果產(chǎn)生較大的偏差。

高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)，是研究微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性的革命性技術(shù)，通過(guò)直接對(duì)樣品中微生物總的DNA進(jìn)行提取測(cè)序，客觀地反映樣品中低豐度和不可培養(yǎng)的微生物。檢測(cè)樣品類別包括食品[10]、醫(yī)藥[11]、環(huán)境[12]、土壤樣品[13]、含菌空氣、植物果實(shí)、動(dòng)物糞便[14-18]等，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確快速。其中二代測(cè)序以Illumina MiSeq平臺(tái)應(yīng)用最為廣泛[19]，微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析主要選擇合適的測(cè)序平臺(tái)和測(cè)序區(qū)域。16S rDNA被認(rèn)為是細(xì)菌分類研究和鑒定的指標(biāo)，通常作為“分子鐘”，16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序是對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定，其序列包含9個(gè)可變區(qū)(variable region)和10個(gè)保守區(qū)(constant region)?？勺儏^(qū)因微生物而異，不同的可變區(qū)域，分析微生物的能力也不同。目前已涉及一個(gè)可變區(qū)(V3、V4、V6)，兩個(gè)可變區(qū)(V1-V2、V3-V4、V4-V5)，以及3個(gè)可變區(qū)(V1-V3、V3-V5、V4-V6)。因此，可根據(jù)研究選擇特定的可變區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)目的區(qū)域的序列變異和豐度，對(duì)特定樣本中微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性等方面進(jìn)行分析比較和研究。

本文采用目前國(guó)標(biāo)方法中的均質(zhì)拍擊取樣法，選擇Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)以及可變區(qū)域V3-V4進(jìn)行測(cè)序，分析調(diào)味面制品中細(xì)菌多樣性，以及對(duì)未來(lái)改進(jìn)加工工藝和控制微生物污染以及調(diào)味面制食品新國(guó)標(biāo)的擬定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用隨機(jī)抽樣方式，于沈陽(yáng)市學(xué)校周邊小食店選購(gòu)調(diào)味面制食品1(樣品規(guī)格28 g，產(chǎn)地沈陽(yáng)市)、2(樣品規(guī)格26 g，產(chǎn)地重慶市)、4(樣品規(guī)格30 g，產(chǎn)地廣州市)。均為預(yù)包裝食品，來(lái)自不同產(chǎn)地相同的流通環(huán)節(jié)，并且存放條件相同。由于調(diào)味面制品國(guó)標(biāo)缺失，樣品均執(zhí)行企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)買(mǎi)后保證樣品存儲(chǔ)條件符合要求，并在保質(zhì)期內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

拍擊式均質(zhì)機(jī)；恒溫水浴鍋；渦旋振蕩器；Eppendorf 5417R冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)、BioPhotometer Plus核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó)艾本德公司；Model 200/2.0 Power Supply水平電泳儀、Bio-Rad S1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀、Versa Doc凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取25 g樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，使用拍擊式均質(zhì)拍打1 min，制成1∶10的樣品勻液。靜置后，吸取上清液40 mL于離心管內(nèi)，2000 r/min離心10 min，去樣品雜質(zhì)沉淀；再吸取上清液20 mL，12000 r/min離心5 min，緩慢棄去上清，獲得菌體沉淀。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行，樣品編號(hào)分別為1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)。

1.3.2 提取樣品基因組DNA

使用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(Bacterial DNA Kit，Omega Bio-Tek公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌總基因組DNA的提取。提取后，檢測(cè)DNA提取的濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌體DNA的完整性。

1.3.3 MiSeq高通量測(cè)序

9. D詞義辨析。A.副詞，太，也。B. 副詞，如此的；連詞，因此。C. 副詞，非常，很；形容詞，恰好是，十足的。D. 形容詞，如此的。結(jié)合語(yǔ)境可知此處指的是，你是如此了不起的一位父親，故選D。

在大量數(shù)據(jù)分析中16S rDNA包含高度保守、中度保守和高度變化的序列區(qū)域，大小適中，與全長(zhǎng)序列測(cè)序相比較足以體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，同時(shí)可降低成本，提高效率。故采用細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)域V3-V4通用引物：

正向引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，

反向引物為805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。

PCR反應(yīng)體系：15 μL 2×Taq Master Mix,1 μL Primer F,1 μL Primer R,20 ng DNA模版，加入ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃延伸20 s，72 ℃退火30 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，等濃度混樣，使用膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物，用于Illumina MiSeq PE250上機(jī)測(cè)序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

為了更加準(zhǔn)確地分析測(cè)序得到的數(shù)據(jù)，去除干擾數(shù)據(jù)，首先根據(jù)Barcode將下機(jī)數(shù)據(jù)(raw data)拆分為不同樣品數(shù)據(jù)，并截去Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列，利用Flash軟件進(jìn)行過(guò)濾拼接，得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)[20-23]。并對(duì)上述數(shù)據(jù)也就是Effective Tags進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類分析(相似性97%)[24]。

本次研究中主要針對(duì)的是細(xì)菌分析，將OTUs代表序列用RDP Classifier(Version 2.2，http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)[25]與Greengene 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://greengenes.lbl.gov/)[26]進(jìn)行物種注釋分析，得到相應(yīng)的物種及物種豐度信息。

同時(shí)計(jì)算Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)以評(píng)估α-多樣性(Alpha diversity)，用豐度分布曲線(OTU rank curve)評(píng)價(jià)豐度及均度，用Venn圖展示不同樣品間特有以及共有OTUs，繪制微生物菌群分布圖和樣品聚類圖[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果及多樣性分析

本試驗(yàn)將3個(gè)產(chǎn)地的調(diào)味面制品進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 調(diào)味面制品樣品16S rDNA測(cè)序情況Table 1 16S rDNA sequencing situation of flavored flour foods

經(jīng)拼接、過(guò)濾[28]等處理，本次試驗(yàn)采集的3個(gè)調(diào)味面制品樣品總共獲得139533條細(xì)菌序列，在97%相似度條件下進(jìn)行劃分后，共得到3744個(gè)OTUs，每個(gè)樣品平均為1248個(gè)。由表1可知，2號(hào)樣品的Chao1指數(shù)為34479，即含有最多細(xì)菌物種種類，物種豐度最高。而1號(hào)樣品的Simpson指數(shù)為0.48，即物種均勻度最好。本次試驗(yàn)覆蓋率(coverage)均在0.97～0.98之間，基本涵蓋樣品中絕大多數(shù)菌群，測(cè)序數(shù)據(jù)量滿足分析的需要。

將數(shù)據(jù)做成指數(shù)箱型圖(見(jiàn)圖1)更可直觀看出，這3個(gè)樣品的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均較高，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則較低。因此，這3個(gè)樣品中的細(xì)菌豐度高，而多樣性低。

圖1 多樣性指數(shù)箱型圖Fig.1 The boxplots of diversity indexes

由圖2可知，來(lái)自廣州市的4號(hào)樣品物種豐度較高，并且它的物種組成也較為均勻。

圖2 豐度分布曲線Fig.2 OTU rank curve

2.2 樣品中核心細(xì)菌菌群及相對(duì)含量分析

本試驗(yàn)測(cè)序經(jīng)過(guò)優(yōu)化平均序列讀長(zhǎng)為429 bp，將所得到的全部OTU比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到10門(mén)、14綱、23目、29科、56屬。本試驗(yàn)中平均相對(duì)含量大于1%的細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、布特菌屬(Buttiauxella)、勒克菌屬(Leclercia)。3個(gè)樣品中，1號(hào)樣品與2號(hào)樣品中芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對(duì)含量均較高，分別為88.08%和50.64%。由圖3可知，調(diào)味面制品樣品初始菌群結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為芽孢桿菌屬和銅綠假單胞菌屬。

圖3 屬水平所有樣品菌群結(jié)構(gòu)分布圖Fig.3 The distribution of microflora structure of all samples at genus level

2.3 Venn圖分析

在相似度為97%的條件下，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了3個(gè)樣品中OTU出現(xiàn)的次數(shù)，利用Venn圖直觀展示了樣品間OTU的重疊情況。結(jié)合它所代表的物種，就可以發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品中的核心微生物。

由圖4可知，出現(xiàn)1次和2次的OTU數(shù)為3621個(gè)和54個(gè)，分別占OTU總數(shù)的96.71%和1.44%，3組樣品的核心OTU數(shù)為15個(gè)，占OTU總數(shù)的0.40%。1號(hào)樣品與2號(hào)樣品共有26個(gè)OTU數(shù)；2號(hào)樣品與4號(hào)樣品共有34個(gè)OTU數(shù)；1號(hào)樣品與4號(hào)樣品共有24個(gè)OTU數(shù)，由此可見(jiàn)，不同產(chǎn)地樣品之間細(xì)菌的多樣性具有很大差異，但是又存在共同的OTU數(shù)，并且核心微生物大致相同，可見(jiàn)在加工工藝以及加工過(guò)程中存在相似的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

圖4 OTU樣本分布韋恩圖Fig.4 OTU sample distribution Venn diagram

2.4 樣品中菌群在屬水平上的分類組成

本試驗(yàn)自定義相對(duì)豐度≥10%的菌群為優(yōu)勢(shì)菌群。從屬的水平描述調(diào)味面制食品中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，包括59個(gè)菌屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、泛菌屬(Pantoea)、布特菌屬(Buttiauxella)、勒克菌屬(Leclercia)、假芽孢桿菌屬(Falsibacillus)、氮單胞菌屬(Azomonas)、Pluralibacter、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、特布爾布爾西菌屬(Trabulsiella)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、拮抗菌(Terribacillus)、冷桿菌屬(Psychrobacter)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Serpens、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、陰溝腸桿菌(Enterobacter)、Kosakonia、Salirhabdus、Allobacillus、嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilus)、堆肥芽孢桿菌屬(Compostibacillus)、短小芽孢桿菌(Lysinibacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、Chryseolinea、少鹽芽孢桿菌屬(Paucisalibacillus)、無(wú)形體屬(Anaplasma)、Ornithinibacillus、約克氏菌(Yokenella)、索氏菌屬(Thauera)、支原菌屬(Mycoplasma)、中華芽孢桿菌屬(Sinibacillus)、Lelliottia、Siccibacter、枝芽孢桿菌(Viridibacillus)、康氏鹽漬芽孢桿菌(Salinibacillus)、太平洋海洋桿菌(Oceanobacillus)、Phenylobacterium、糖芽孢桿菌屬(Saccharibacillus)、弗氏檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、Samsonia、新衣原體屬(Neochlamydia)、海洋紅樹(shù)林菌屬(Mangrovibacterium)、弓形桿菌(Arcobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)、Thiopseudomonas、Halalkalibacillus、馬賽菌屬(Massilia)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Fontibacillus、奇異單胞菌(Allomonas)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、根瘤菌屬(Mesorhizobium)、嗜麥芽窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Endozoicomonas。進(jìn)化關(guān)系見(jiàn)圖5。

圖5 屬水平所有樣品群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.5 The distribution of microflora structure of all samples at genus level

而利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法檢驗(yàn)調(diào)味面制品，僅發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬1個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，包括糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)以及黃褐假單胞菌(Pseudomonasfulva)2株菌，雖然調(diào)味面制品產(chǎn)地不同，但是它們的優(yōu)勢(shì)菌中均包括假單胞菌屬，本次試驗(yàn)共檢出50余種菌，由此可見(jiàn)，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法無(wú)法反映出樣本中低豐度物種，可能存在對(duì)樣本微生物的菌群及優(yōu)勢(shì)菌片面的分析和判斷[29]。

3 討論

本次試驗(yàn)樣品均購(gòu)于同一超市，流通環(huán)節(jié)以及存放方式相同，但產(chǎn)地不同。由圖5可知，各樣品之間的主要菌群結(jié)構(gòu)和比例不盡相同。很可能由于不同樣品的加工工藝以及產(chǎn)地環(huán)境各不相同。從門(mén)的水平上，3種調(diào)味面制食品中的微生物菌群主要為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)與變形菌門(mén)(Proteobacteria)，占總菌數(shù)的50%～90%，此外還存在少量的擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和螺旋體門(mén)(Spirochaetes)。3種調(diào)味面制食品在屬的水平上表現(xiàn)出一定的差異，圖3展示了樣品中物種豐度較高的前50個(gè)屬水平序列信息。在這些物種豐度較高的50個(gè)序列中，選取的3種調(diào)味面制食品樣品在菌群結(jié)構(gòu)上存在一定的相似性，3種均包含芽孢桿菌屬(Bacillus)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、布特菌屬(Buttiauxella)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)。芽孢桿菌屬、泛菌屬、不動(dòng)桿菌屬?gòu)V泛分布于自然界，而乳球菌屬和雙歧桿菌屬為益生菌，常用于乳制品發(fā)酵。值得注意的是，其中銅綠假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬為致病菌，在調(diào)味面制食品中發(fā)現(xiàn)礦泉水中常見(jiàn)的致病菌——銅綠假單胞菌屬，極有可能是生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)產(chǎn)生了交叉污染、用水不衛(wèi)生等?？梢?jiàn)，為保證產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量，加強(qiáng)生產(chǎn)規(guī)范化，管理標(biāo)準(zhǔn)化，有效監(jiān)控微生物風(fēng)險(xiǎn)尤為重要。還有某些菌屬可能處于“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable state， VBNC)” ，即喪失細(xì)菌可培養(yǎng)的特征，但是細(xì)胞膜完整，有一定的代謝活力，遇到適宜條件，可恢復(fù)到可培養(yǎng)的狀態(tài)，例如生長(zhǎng)溫度在37 ℃的泛菌屬、明串珠菌屬和不動(dòng)桿菌屬。

高通量測(cè)序技術(shù)可以跳過(guò)傳統(tǒng)微生物耗時(shí)較長(zhǎng)的培養(yǎng)步驟，直接提取多個(gè)樣品中微生物基因組信息，更全面客觀地反映樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，具有高效、準(zhǔn)確、低成本的優(yōu)勢(shì)，但它同時(shí)具有相對(duì)的局限性。首先，高通量測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)信息，要將這些數(shù)據(jù)加以總結(jié)歸類，建立微生物多樣性的模型，需要生物信息學(xué)的專業(yè)背景；其次，高通量測(cè)序技術(shù)雖然可以檢測(cè)出樣品中不可培養(yǎng)的微生物，但是并不能確定此微生物是否存活，需要結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行比較。

本文采用均質(zhì)拍擊法提取食品樣品的微生物基因組，利用高通量測(cè)序技術(shù)(MiSeq)對(duì)可變區(qū)域V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，為后續(xù)食品中微生物研究提供了新思路和方法。

研究表明，調(diào)味面制食品中微生物多樣性較低，3種調(diào)味面制食品中微生物菌群結(jié)構(gòu)具有一定相似性，其中值得引起重視的是致病菌銅綠假單胞菌屬的發(fā)現(xiàn)，由于此次未對(duì)真菌類進(jìn)行測(cè)序，但仍有部分未確定的菌株，需要進(jìn)一步研究，在食品安全問(wèn)題可能發(fā)生之前，采取有效的預(yù)防措施，將危害系數(shù)降到最低。同時(shí)加強(qiáng)食品生產(chǎn)工藝流程衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化，保證食品質(zhì)量安全。