金克勤， 駱健峰，2▲△， 蘇愛(ài)芳， 丁明星， 傅賽紅 ， 方遠(yuǎn)書(shū)

（1金華市婦幼保健院遺傳實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321000；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院分子實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321000；3金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321007；4金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，金華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 金華 321000）

盆腔器官脫垂（pelvic floor prolapse，POP）最重要的手術(shù)治療方式——盆底重建手術(shù)已占到普通婦科大手術(shù)的40%~60%。由于盆底結(jié)構(gòu)及力學(xué)的復(fù)雜性，有高達(dá)19%的術(shù)后復(fù)發(fā)率，存在再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，在盆底重建中，利用脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）構(gòu)建組織工程補(bǔ)片，是一種潛在的治療策略［2］，在臨床上有巨大的應(yīng)用潛能［3］。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）在增殖和細(xì)菌/病毒感染風(fēng)險(xiǎn)方面更具優(yōu)勢(shì)，且移植排斥反應(yīng)機(jī)率低。然而，有關(guān)UC-MSCs 應(yīng)用于盆底重建的研究較少，需更多的證據(jù)。應(yīng)用絲心蛋白（silk fibroin，SF）、膠原（collagen，COL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）等網(wǎng)狀支架的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，輔加UCMSCs 的支架材料修復(fù)效果優(yōu)于單純的支架材料，其機(jī)制可能與促進(jìn)血管新生、減少局部粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及免疫調(diào)節(jié)等有關(guān)［4-5］。本研究采用復(fù)合UC-MSCs 與SF/COL/聚（左旋乳酸-己內(nèi)酯）［poly（L-lactide-co-ε-caprolactone），PLCL］靜電紡絲納米纖維支架構(gòu)建新型盆底補(bǔ)片，并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，探索其修復(fù)的可行性，為其在女性盆底重建手術(shù)中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，4 周齡，購(gòu)自上海斯萊克有限公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)為20170005019883。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2015-0008。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合國(guó)科發(fā)財(cái)字〔2006〕398號(hào)文件規(guī)定。

2 主要試劑

人UC-MSCs由浙江思丹姆干細(xì)胞生物科技有限公司提供；SF 委托天津醫(yī)院提??；豬I 型COL 購(gòu)自成都市科樂(lè)生物技術(shù)有限公司；PLCL 由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司提供；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript-ⅡQ RT SuperMix for qPCR（Vazyme）；PrimeScript ? RT Reagent Kit（TaKaRa）；實(shí)驗(yàn)引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、純化；大鼠I 型及III 型COL 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 用攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒轉(zhuǎn)染人UC-MSCs 將成品UCMSCs 傳代并擴(kuò)增后，將細(xì)胞懸浮接種到24 孔板中，每孔均加入3.5×104個(gè)細(xì)胞，靜置過(guò)夜。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到60%時(shí)，換液，加入針對(duì)不同的MOI值相對(duì)應(yīng)的病毒量。病毒感染8 h 后換液，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，最終病毒滴度為1×1011TU/L 的病毒顆粒。然后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 靜電紡絲三維納米纖維支架的制備 SF/COL/PLCL 靜電紡絲三維納米纖維支架的制備過(guò)程如下［6-7］：將純 SF 與 COL 按質(zhì)量比為 70∶30 溶于六氟異丙醇（hexafluoroisopropanol，HFIP）中，得到8%的共混溶液，再將最佳配比的SF/COL 與PLCL｛PLLA［poly（L-lactide）］∶PCL［poly（caprolactone）］=75∶25｝分別按 100∶0、70∶30、50∶50、30∶70 和 0∶100 的質(zhì)量比溶于HFIP 中，配制成8%的紡絲液，在電壓為11 kV、接收距離12 cm、噴速1.5 mL/h 的條件下進(jìn)行靜電紡絲，電紡后的支架在真空干燥箱內(nèi)充分干燥。

3.3 納米纖維支架形貌表征觀察與植入前后力學(xué)性能檢測(cè) （1）用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM；HITACHI SU8010）觀察納米纖維支架纖維形態(tài)，通過(guò)分析軟件測(cè)量纖維直徑，計(jì)算其直徑的分布范圍和纖維的平均直徑，分析SF/COL 與PLCL 不同比例對(duì)其納米纖維直徑的影響。（2）采用多功能材料力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)（MTS-Exceed-Model E42 及INSTRON-2716-020）對(duì)納米纖維支架的植入前后不同時(shí)間段的力學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。以10 mm/min 的加載速率對(duì)樣品進(jìn)行拉伸，直至完全拉斷。經(jīng)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)輸出數(shù)據(jù)并繪制應(yīng)力一形變量曲線，記錄樣品最大失效力（N）并計(jì)算楊氏模量（MPa）。

3.4 UC-MSCs 在納米纖維支架上生長(zhǎng)及增殖情況的檢測(cè) 將慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)UC-MSCs接種在三維納米纖維支架上，UC-MSCs 接種后 5、7 和9 d 進(jìn)行 SEM（Nova NanoSEM? 450；Thermo Fisher Scientific）形態(tài)學(xué)觀察，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

3.5 埋植實(shí)驗(yàn) 將12只SD 大鼠隨機(jī)分為2組，10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉后，仰臥位固定，腹部備皮消毒，切開(kāi)腹側(cè)壁約1 cm。實(shí)驗(yàn)組：將負(fù)載UCMSCs 的SF/COL/PLCL 補(bǔ)片植入大鼠腹部皮下；對(duì)照組：?jiǎn)渭僑F/COL/PLCL 補(bǔ)片植入大鼠腹部皮下。用普里靈線縫合固定一針，可吸收線縫合切口。于術(shù)后1 周、4 周、12 周活體成像觀察動(dòng)態(tài)追蹤移植細(xì)胞的存活、分布，并分別處死大鼠后對(duì)補(bǔ)片進(jìn)行取材。

3.6組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 將樣品立即固定在4%多聚甲醛中，通過(guò)乙醇梯度脫水，清除并包埋在石蠟塊中。使用切片機(jī)（LEICA）準(zhǔn)備組織切片（4~5 μm），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蘇木精-伊紅及Masson 三色方案進(jìn)行染色，觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化情況，腹部壁組織CD31 免疫組化染色標(biāo)記檢測(cè)新生血管。在1、4 和12 周組中對(duì)切片進(jìn)行處理，通過(guò)光學(xué)顯微鏡半定量評(píng)估局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化和新生血管情況。單個(gè)載玻片以0~4 評(píng)分。炎癥評(píng)分：0 分為未見(jiàn)炎癥細(xì)胞；1 分為每高倍鏡視野（×400）可見(jiàn)1~10 個(gè)炎癥細(xì)胞；2 分為每高倍鏡視野（×400）可見(jiàn)10~30 個(gè)炎癥細(xì)胞；3 分為明顯浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞；4 分為可見(jiàn)形成包裹。纖維化評(píng)分：0 分為未見(jiàn)膠原纖維；1 分為可見(jiàn)局限的膠原纖維；2 分為可見(jiàn)中厚膠原纖維；3 分為可見(jiàn)厚膠原纖維；4分為可見(jiàn)廣泛膠原纖維［8］。

HE 染色：將切片置于二甲苯中脫蠟，然后于無(wú)水乙醇中浸泡，最后自來(lái)水浸洗。將切片浸入蘇木素染液染色5 min，水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水中返藍(lán)，將切片浸入伊紅染液中染色3~5 min，再經(jīng)梯度乙醇與二甲苯脫水透明，中性樹(shù)膠封固，做好相關(guān)標(biāo)記。

Masson 染色：將切片置于二甲苯中脫蠟，然后于無(wú)水乙醇中浸泡，最后自來(lái)水浸洗。將切片浸入37 ℃Bouin 液2 h，水洗至無(wú)黃色。天青石藍(lán)染色液3 min；稍水洗；Mayer 蘇木素染色液滴染 3 min；稍水洗；酸性乙醇分化液分化數(shù)秒；流水沖洗10 min；麗春紅品紅染液染10 min，蒸餾水稍沖洗；磷鉬酸水溶液處理約10 min，直接用苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min、1%冰醋酸處理2 min，顯微鏡下觀察染液的染色效果；再經(jīng)梯度乙醇與二甲苯脫水透明，中性樹(shù)膠封固，做好相關(guān)標(biāo)記。

腹部壁組織CD31 免疫組織化學(xué)染色：切片二甲苯脫蠟，然后于無(wú)水乙醇中浸泡，最后PBS 浸洗。然后切片于 37 ℃、3% H2O2孵育 15 min，PBS 沖洗 3 次，每次3 min；置0.01 mmol/L 枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中水煮修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫，PBS 沖洗3 次，每次3 min；滴加Ⅰ抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，轉(zhuǎn)至室溫平衡 30 min，PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育 30 min，PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；DAB 反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，干燥，封片，拍照；光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.7 RT-qPCR 檢測(cè)白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、IL-8 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)量 兩組大鼠于術(shù)后1、4 和12周，麻醉后處死，取出補(bǔ)片及周圍組織。采用TRIzol試劑分離細(xì)胞的總RNA，依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以β-actin 為內(nèi)參照，采用RT-qPCR 進(jìn)行IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 和 β-actin 產(chǎn)物擴(kuò)增及結(jié)果分析。RT-qPCR 條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers used for RT-qPCR

3.8 I 型及 III 型 COL 含量檢測(cè) 移植后 1、4 和 12周不同時(shí)點(diǎn)每組大鼠補(bǔ)片樣本均按照I 型及III 型COL ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)中方法處理，樣品處理完畢后置于酶標(biāo)儀（MD-SpectraMax Plus 384）中，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)定吸光度，計(jì)算大鼠補(bǔ)片樣本中 I 型 及 III 型 COL 濃 度 ，計(jì) 算 I 型 COL/III 型 COL比值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Kolmogorov-Smirnov 法對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。正態(tài)分布資料組間比較采用t檢驗(yàn)及重復(fù)測(cè)量方差分析，非正態(tài)分布資料及等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。定性資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SF/COL/PLCL 纖維支架SEM表征和力學(xué)表征

SEM 圖片顯示，SF/COL/PLCL 纖維支架纖維的直徑為（782.8±121.3）nm，成功制備了 SF/COL/PLCL 纖維支架，見(jiàn)圖1。SF/COL/PLCL 纖維支架的拉力測(cè)試測(cè)得其拉伸斷裂應(yīng)力為（3.92±0.48）MPa，此時(shí)斷裂伸長(zhǎng)率為（56.53±15.72）%，拉伸彈性模量為（93.68±8.18）MPa，見(jiàn)圖2。

2 接種納米纖維支架不同時(shí)間后細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖情況

Figure 1. SEM micrographs of SF/COL/PLCL at different magnifications.圖1 SEM不同放大倍數(shù)觀察最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SF/COL/PLCL 三維納米纖維支架的表面形態(tài)

Figure 2. Stress-strain curves of SF/COL/PLCL fiber scaffolds.圖2 SF/COL/PLCL 纖維支架的應(yīng)力應(yīng)變曲線

慢病毒轉(zhuǎn)染的UC-MSCs 植入納米纖維支架后，第5 天細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，SEM 觀察到UC-MSCs 在納米纖維支架的外表面和網(wǎng)格內(nèi)部有粘附生長(zhǎng)，少量細(xì)胞聚集成片，呈不規(guī)則長(zhǎng)形，細(xì)胞貼壁聚集且有細(xì)小空隙；第7 天細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，延伸強(qiáng)，增殖能力明顯增強(qiáng)，較第5 天細(xì)胞團(tuán)增多，細(xì)胞貼壁聚集成片的有開(kāi)裂空隙；到第9天，細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和結(jié)構(gòu)斷開(kāi)，SEM 下可見(jiàn)更多的不規(guī)則網(wǎng)狀細(xì)胞團(tuán)，呈現(xiàn)細(xì)胞貼壁聚集成片的有開(kāi)裂，邊緣呈蛛網(wǎng)狀，見(jiàn)圖3。植入后以同時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組存活率為100%相比，第5、7 和9 天的存活率分別為（137.98±4.53）%、（141.36±1.70）%和（85.92±2.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞活力在接種5 d 后增加，第9 天開(kāi)始下降。

3組織病理學(xué)評(píng)估

HE染色顯示單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組在第1周和第4 周顯示出清晰的支架結(jié)構(gòu)。隨著時(shí)間的推移及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)展，局部組織腫脹壞死、凋亡、吞噬，支架慢慢降解，補(bǔ)片結(jié)構(gòu)中間逐步形成空洞，到第12 周，支架中心區(qū)域不再可見(jiàn)，周圍組織覆蓋周邊區(qū)域。在負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組中，納米纖維膜在第1 周時(shí)仍然完好無(wú)損，但UC-MSCs 黏附于支架并已形成細(xì)胞層，且炎癥細(xì)胞已顯著浸潤(rùn)，見(jiàn)圖4。

支架結(jié)構(gòu)在第4 周完全分解，到第12 周，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)已經(jīng)消退，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分較單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組無(wú)顯著差異。Masson 和免疫組化染色顯示，負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組與大鼠組織的整合表現(xiàn)較強(qiáng)；基于CD31標(biāo)記的血管存在，支架已完全降解，被軟組織取代，有廣泛血管生成的證據(jù)。單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組與大鼠組織的整合較差，植入12周仍可見(jiàn)支架。與單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組相比，負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組顯示出明顯更多的CD31 標(biāo)記的血管及更高程度的纖維化（P＜0.01）。見(jiàn)圖5及表2。

表2 不同時(shí)點(diǎn)SF/COL/PLCL組和UC-MSCs+SF/COL/PLCL組的組織病理學(xué)評(píng)估Table 2. The semi-quantitative pathohistological assessment of the SF/COL/PLCL and UC-MSCs+SF/COL/PLCL groups at different time points after implantation（Mean±SD. n=5 to 6）

4 RT-qPCR 檢測(cè)IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α 的相對(duì)表達(dá)量

植入支架周圍組織中 IL-2、IL-6、IL-8 和 TNF-α的相對(duì)水平隨著時(shí)間的推移呈普遍下降趨勢(shì)。與單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組相比，負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組在植入后1 和4 周時(shí)周圍組織中的IL-6 水平略有升高，12 周時(shí)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組各時(shí)點(diǎn)IL-2、IL-8和TNF-α的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 植入后不同時(shí)點(diǎn)炎性細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)水平Table 3. The relative expression levels of inflammatory cytokines at different time points after implantation（Mean±SD. n=4）

5 補(bǔ)片植入后的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸和力學(xué)性能

隨時(shí)間增長(zhǎng)，兩組I 型COL/III 型COL 比值均增加。與單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組相比，負(fù)載UCMSCs組 I 型 COL/III 型 COL 比值增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

Figure 3. Scanning electron microscopic images showing the morphological changes of umbilical cord mesenchymal stem cells（UCMSCs）at different time points after implantated onto the nano-fibrous scaffolds. The red arrow indicates the loaded cells，and the cells delineated by the red border are further observed at×500 and ×2 500 magnification.圖3 掃描電鏡上不同放大倍數(shù)觀察UC-MSC細(xì)胞接種到納米纖維支架上不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)情況

Figure 4. Morphological observation of the scaffolds in each group at 1 week（HE staining，scale bar=25μm）.圖4 1周時(shí)HE染色后兩組支架的形態(tài)學(xué)觀察

因第4 及12 周補(bǔ)片已降解，取第1 周的補(bǔ)片進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)，記錄樣品最大失效力（N）并計(jì)算楊氏模量（MPa）。植入后1周，負(fù)載UC-MSCs補(bǔ)片組與單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組的最大載荷差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組的彈性模量高于單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

討 論

本研究顯示SF/COL/PLCL 靜電紡絲納米纖維支架初始的拉伸斷裂應(yīng)力達(dá)到了（3.92±0.48）MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為（56.53±15.72）%，拉伸彈性模量為（93.68±8.18）MPa，該支架起支持細(xì)胞黏附、實(shí)現(xiàn)力學(xué)支撐的作用。此外，以UC-MSCs 作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程補(bǔ)片，UC-MSCs 的形態(tài)在體外培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定，在體外將UC-MSCs 細(xì)胞在接種納米纖維支架后生長(zhǎng)良好，接種支架7 d 時(shí)，細(xì)胞活力最強(qiáng)且細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)，伸展較好且細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密，展現(xiàn)了良好的細(xì)胞相容性。

Figure 5. Pathohistological analysis of the naked and UC-MSCs+SF/COL/PLCL nano-membrane. The black arrow shows inflammatory cell infiltration，and the yellow arrow marks the position of the scaffold. Masson staining shows collagen fibers. CD31 immunohistochemical staining shows neovascularization.圖5 12周時(shí)各組組織病理學(xué)染色分析

生物材料植入機(jī)體后往往會(huì)立即啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)不僅導(dǎo)致局部組織腫脹壞死，同時(shí)還引起較強(qiáng)的纖維化，導(dǎo)致網(wǎng)片變形收縮，局部組織硬度增加，網(wǎng)片出現(xiàn)侵蝕等。本研究中負(fù)載UCMSCs 補(bǔ)片組1 周時(shí)組織學(xué)評(píng)分明顯高于單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組，且鏡下炎癥細(xì)胞明顯較多，但隨著在體時(shí)間延長(zhǎng)結(jié)構(gòu)降解較快，12 周時(shí)負(fù)載UCMSCs 補(bǔ)片組受試位置補(bǔ)片已經(jīng)降解，而大鼠活體成像顯示負(fù)載UC-MSCs補(bǔ)片組隨著在體時(shí)間延長(zhǎng)體內(nèi)分布更廣，可能與組織相融合有關(guān)。因?yàn)榇藭r(shí)組織可見(jiàn)大量膠原纖維及新生血管生成，組織纖維化評(píng)分及血管數(shù)負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組均明顯高于單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組。隨時(shí)間增長(zhǎng)，兩組Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值均增長(zhǎng)，負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組相對(duì)較快，而新生血管及膠原纖維大量增加有利于POP 患者盆底組織修復(fù)，并對(duì)器官起支撐作用。同時(shí)，較單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組，早期階段（1 周、4 周）負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組的炎癥因子水平 IL-6、IL-8 和 TNF-α相對(duì)增高，此與組織學(xué)觀察到的炎性細(xì)胞的早期浸潤(rùn)要比單純SF/COL/PLCL 補(bǔ)片組中更強(qiáng)表現(xiàn)一致，這可能與宿主對(duì)基質(zhì)膠的降解和吸收的反應(yīng)有關(guān)［9］。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可能由于UC-MSCs 發(fā)揮了免疫抑制能力，并且可以抑制刺激的淋巴細(xì)胞的增殖有關(guān)［10］，負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組下降速率相對(duì)較快。而及時(shí)終止炎癥與血運(yùn)重建早期發(fā)作是相互依存的［11］，早期高水平的炎癥因子能夠促進(jìn)新生血管生成，如IL-6 是一種多功能細(xì)胞因子，Gopinathan等［12-15］研究顯示，IL-6 可以直接刺激血管生成、誘導(dǎo)離體血管發(fā)芽、影響細(xì)胞增殖等，其與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相似的功效，但持續(xù)的炎癥過(guò)程血管生成發(fā)育明顯滯后，如IL-6 的高水平會(huì)造成總生存期下降［16］，而MSCs因具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，影響局部炎癥微環(huán)境，使得負(fù)載UC-MSCs補(bǔ)片組新生血管生成后，炎癥因子及時(shí)終止，避免了過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和過(guò)強(qiáng)的纖維化帶來(lái)的損害。UC-MSCs 還能分泌多種神經(jīng)元相關(guān)的生長(zhǎng)因子，例如營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，有助于組織修復(fù)［17-18］。

Figure 6. The ratio of collagen type I to collagen type III at different time points in each group. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs SF/COL/PLCL group圖6 各組別不同時(shí)點(diǎn)Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值

Figure 7. The maximum load（A）and elastic modulus（B）of synthetic implants for pelvic reconstructive surgery.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs SF/COL/PLCL group.圖7 兩組補(bǔ)片在體最大載荷和彈性模量

進(jìn)一步研究表明，植入大鼠后1 周，負(fù)載UCMSCs 補(bǔ)片組與單純補(bǔ)片組的最大載荷無(wú)明顯差異，但負(fù)載UC-MSCs 補(bǔ)片組的彈性模量較高?？梢?jiàn)UCMSCs 可改善組織工程支架的生物力學(xué)性能，使其具有更強(qiáng)順應(yīng)性和韌性，避免網(wǎng)片變形收縮。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，負(fù)載UC-MSCs 的SF/COL/PLCL 靜電紡絲納米纖維支架展現(xiàn)了良好的細(xì)胞相容性，更強(qiáng)順應(yīng)性和韌性，及良好的抗炎性和組織修復(fù)能力，可滿足盆底重建要求，具有良好應(yīng)用前景。