陳 怡 劉文華 王 莉 歐 洋 韓 雪 閔冬雨

治未病臍貼是作用于神闕穴的外治藥物[1]，組成為：大黃、龍眼肉、花椒、艾葉以上4味，屬深褐色的丸劑，有香氣。大黃味苦，性寒，入胃、大腸、肝經(jīng)；龍眼肉味甘，性溫，歸心、脾經(jīng)；花椒味辛，性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)；艾葉味辛、苦，性溫，歸肝、脾、腎經(jīng)。諸藥苦寒甘溫共濟，斡旋司斯，共奏理中之效[2]。由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院研發(fā)創(chuàng)立，應用多年臨床療效顯著，為保證其質(zhì)量標準，根據(jù)《中華人民共和國藥典》[3](以下簡稱《中國藥典》)各項相關規(guī)定，最終選用以大黃中的游離蒽醌和總蒽醌[4]的含量作為測定指標，用于控制本制劑質(zhì)量標準，結果表明此法可用于治未病臍貼的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑ZF-I型三用紫外分析儀 (上海顧村電光儀器廠)，Agilent 1100液相色譜儀，Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。樣品及對照藥材、蘆薈大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品、土大黃苷、艾葉對照藥材、桉油精對照品、桂圓對照藥材、花椒對照藥材均來自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心。

1.2 定性鑒別

1.2.1 顯微鏡法取本品5 g，置離心管中，加50～60 ℃熱水50 ml，振搖，使藥物混懸，置離心機離心，傾去上清液，沉淀再加熱水30 ml，振搖，離心，反復2次，得離心沉淀物，水浴蒸干，置顯微鏡下觀察：外果皮細胞垂周壁連珠狀增厚(花椒)；T型非腺毛，頂端細胞長而彎曲，兩臂不等長，柄2～4細胞，單列性非腺毛，3～5細胞，頂端細胞特長而扭曲，常斷落；腺毛表面管鞋底行，由4～6細胞相對疊合而成，無柄(艾葉)；草酸鈣簇晶(大黃、花椒)。見圖1。

注：A.非腺毛；B.腺毛；C.腺毛；D.草酸鈣簇晶和內(nèi)果皮細胞；E.外果皮細胞。

1.2.2 薄層色譜法(TLC)取本品3 g，剪碎，加乙酸乙酯30 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 ml溶解，作為供試品溶液[5]。另取龍眼肉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。對照薄層色譜法(通則0502)[6]實驗，吸取上述2種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑、展開、取出、晾干置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

注：1.對照藥材溶液；2.供試品溶液；3.陰性液。

1.3 大黃游離蒽醌的高效液相色譜含量測定方法

1.3.1 色譜條件色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以甲醇-0.1%磷酸溶液(65∶35),檢測波長254 nm。流速1.0 ml/min。柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)≥3000，分離度≥1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

1.3.2 對照品溶液的制備精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別制成每1 ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80 μg，大黃素甲醚40 μg溶液；分別精密量取上述對照品溶液各2 ml，混勻，即得(每1 ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16 μg，大黃素甲醚8 μg)。見圖2。

1.3.3 供試品溶液制備方法對比直接回流提取法、浸泡過夜后回流提取法和加適量硅藻土分散回流提取法后，選取含量準備、操作精當?shù)牡?種方法，取本品適量，剪碎，取約25 g，精密稱定，置塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，稱定重量，放置過夜后，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻、濾過取續(xù)濾液即得供試品溶液。

1.3.4 陰性液干擾實驗取方中除大黃外的各藥材，按制備工藝制成樣品，再按“1.3.3供試品溶液的制備”項下制備成缺大黃陰性液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性液各10 μl注入液相色譜儀，繪制液相色譜圖，結果在與對照品色譜峰相應的位置上供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，陰性液在此峰位無吸收。見圖2。

1.3.5 線性范圍考察按上述色譜條件測定峰面積，以進樣濃度為橫坐標X，色譜峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，經(jīng)線性回歸，得回歸方程為：蘆薈大黃素Y=47774.409X-4.429，r=0.9998，進樣量在0.03125～0.5 μg內(nèi)線性關系良好；大黃酸Y=43075.564X-1.258，r=0.9999，進樣量在0.036375～0.582 μg內(nèi)線性關系良好；大黃素Y=34449.900X-0.771，r=0.9998，進樣量在0.036875～0.59 μg內(nèi)線性關系良好；大黃酚Y=53092.288X-1.217，r=0.9999，進樣量在0.04075～0.652 μg內(nèi)線性關系良好；大黃素甲醚Y=35530.975X-6.363，r=0.9999，進樣量在0.022～0.352 μg內(nèi)線性關系良好。取對照品配置成不同濃度溶液，吸取10 μl，注入液相色譜儀中。見表1。

表1 線性范圍考察結果

1.3.6 穩(wěn)定性實驗取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h，按正文含量測定方法測定峰面積，結果表明，本品溶液于8 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性實驗

1.3.7 精密度實驗取同一對照品溶液按上述色譜條件操作，同法測定6次，結果表明，本方法精密度較高。見表3。

表3 精密度實驗

1.3.8 重復性試驗取同一批號樣品6份，分別按樣品含量測定方法測定，結果表明，本方法重復性較好。見表4。

表4 重復性實驗

1.3.9 回收率試驗精密稱取已知含量的樣品共6份，分別加入適量對照品，按供試品制備方法制備，測定含量，結果表明，本方法加樣回收率良好。見表5。

表5 回收率實驗

1.4 總蒽醌含量測定

1.4.1 色譜條件同[游離蒽醌]含量測定項下。

1.4.2 對照品溶液的制備取[游離蒽醌]含量測定項下對照品溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備取1.2.2項下供試品溶液，精密量取5 ml，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.4 陰性液干擾實驗取方中除大黃外的各藥材，按制備工藝制成樣品，再按“1.2.2供試品溶液的制備”項下制備成缺大黃陰性液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性液各10 μl注入液相色譜儀，繪制液相色譜圖，結果在與對照品色譜峰相應的位置上供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，陰性液在此峰位無吸收。見圖2。

1.4.5 線性范圍考察取對照品配置成不同濃度溶液，吸取10 μl，注入液相色譜儀中，結果見下表。

1.4.6 穩(wěn)定性實驗取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h按正文含量測定方法測定峰面積，結果表明，本品溶液于8 h內(nèi)穩(wěn)定。見表6。

表6 穩(wěn)定性實驗

1.4.7 精密度實驗同1.3.7[游離蒽醌]含量測定項下。

1.4.8 重復性實驗取同一批號樣品6份，分別按樣品含量測定方法測定，結果表明，本方法重復性較好。見表7。

表7 重復性實驗

1.4.9 回收率實驗精密稱取已知含量的樣品共6份，分別加入適量對照品，按供試品制備方法制備，測定含量，結果表明，本方法加樣回收率良好。見表8。

1.5 樣品含量測定按游離蒽醌和總蒽醌含量測定方法對樣品進行含量測定。見表9。

表9 樣品含量測定結果

2 討論

本品由龍眼肉、花椒、艾葉、大黃組成，根據(jù)《中國藥典》[3]各項下相關規(guī)定，龍眼肉、花椒沒有指標性成分可以控制含量，艾葉中以桉油精為含量測定指標，但是桉油精專屬性差，因此最終選用以大黃中的游離蒽醌和總蒽醌的含量作為測定指標，用于控制本制劑質(zhì)量。經(jīng)過反復試驗，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在現(xiàn)行色譜條件下得到了很好的分離。重復性好、精密度高、穩(wěn)定性強，陰性液無干擾，在所用色譜條件下，理論塔板數(shù)≥3000，分離度≥1.5，拖尾因子在0.95～1.05，是較為成熟的含量測定方法。以此確定的質(zhì)量標準測定可信度高，可以接納為質(zhì)量標準。

3 結果與結論

根據(jù)以上樣品測定結果及《中國藥典》[3]中大黃項下相關規(guī)定，定為本品標準為含游離蒽醌以蘆薈大黃素(C15H10O5)、大黃酸(C15H8O6)、大黃素(C15H10O5)、大黃酚(C15H10O4)和大黃素甲醚(C16H12O5)的總量計，不得少于0.002%；含總蒽醌以蘆薈大黃素(C15H10O5)、大黃酸(C15H8O6)、大黃素(C15H10O5)、大黃酚(C15H10O4)和大黃素甲醚(C16H12O5)的總量計，不得少于0.015%。