張文平 劉姿 賈建超 魏立 張曉菊

1 河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南大學(xué)人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,鄭州 450003;2河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南大學(xué)人民醫(yī)院 胸外科/肺移植科,鄭州450003

人氣道基底細(xì)胞存在于氣管和較大支氣管的上皮內(nèi),是復(fù)層纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞的祖細(xì)胞,約占假?gòu)?fù)層黏膜纖毛上皮細(xì)胞的30%?；准?xì)胞緊緊黏附于氣道黏膜上皮的基底層,不像其他類型的上皮細(xì)胞(如復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞、分泌細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞)那樣向管腔內(nèi)延伸[1]。人氣道基底細(xì)胞特異性表達(dá)基因包括編碼轉(zhuǎn)錄因子Trp63、細(xì)胞角蛋白Krt5、整合蛋白α6(Itga6)、平足蛋白(Pdpn,另名T1α)和跨膜神經(jīng)因子生長(zhǎng)因子受體(Nfgr,另名p75)[2]。基底細(xì)胞在氣道損傷后的再生修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。近年來利用氣道基底細(xì)胞體外培育肺的類器官用于研究肺部疾病發(fā)病機(jī)制和藥物試驗(yàn)是研究熱點(diǎn)[3]?；准?xì)胞的分離和培養(yǎng)是體外試驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)。本文介紹使用人氣管或支氣管標(biāo)本分離原代基底細(xì)胞及其培養(yǎng)傳代的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

氣管和較大的支氣管標(biāo)本來源于河南省人民醫(yī)院肺移植中心肺移植手術(shù)棄用的供肺和切除的病肺。無菌條件下使用手術(shù)器械將氣管、左右主支氣管或葉段支氣管分離出來,離斷并保存于含美羅培南100μg/mL、萬古霉素20μg/mL 和兩性霉素B 250 ng/mL的PBS中,標(biāo)本保存在4 ℃冰箱,時(shí)間不超過12 h,應(yīng)盡快進(jìn)行分離氣道基底細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑與器材

含谷氨酰胺DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 11995073),EpiX Base培養(yǎng)液(Propagenix 276-201),Ham's F-12 Nutrient Mix(Thermo Fisher 11765062);膠原酶P(Sigma-Aldrich 11213873001),蛋白酶XIV(Sigma-Aldrich P5147),DNase Ⅰ(Sigma-Aldrich 10104159001),Purecol(Sigma-Aldrich 5006),p63-α(D2K8X)XP?RabbitmAb(Cell Signaling Technology 13109S),Anti-KRT5 mousemAb(Sigma-Aldrich SAB4100508),Goat anti-Rabbit IgG-Cy3(Bio Vision 6903-250),Goat Anti-Mouse IgG-Cy5(Southern Biotech 1030-15),Alexa Fluor 647 goat anti-Rabbit IgG (Novus Biologicals NBP1-72732AF647);0.01 mol/L HCl,二硫蘇糖醇(DTT),1%(v/v)青霉素/鏈霉素(工作濃度100 ng/mL),5% (v/v)慶大霉素(Sigma-Aldrich G1272,工作濃度500 ng/mL),美羅培南(Pharmacy 63323050830,工作濃度100μg/mL),萬古霉素(Pharmacy 6332302840,工作濃度20μg/mL),兩性霉素B(Thermo Fisher BP2645-50,工作濃度250 ng/mL),乳酸林格氏液(Abbot#7953),0.05%(v/v)胰蛋白酶-EDTA 酚紅(Thermo Fisher Scientific 25300120),FBS,Di H2O,DMSO,2%(v/v)多聚甲醛,BSA,0.3% (v/v)Triton X-100,Ever BriteTMHardset Mounting Medium with DAPI(Biotum 23004),ViaStainTMAOPI 染液(Thermo Fisher NC0285242);0.2μm過濾器(Thermo Scientific F2613-17),Nunc?Lab-Tek ⅡCC2 Chamber Slide System(Thermo Scientific 154917 PK),無菌手術(shù)刀、手術(shù)剪和鑷子,培養(yǎng)皿,長(zhǎng)頸培養(yǎng)瓶(T75 T175),Falcon離心管(15mL/50mL Fisher Scientific 14-959-70C 14-959-49a),細(xì)胞計(jì)數(shù)板,CO2溫箱,自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀2000(Nexcelom Biosicence)。

1.2 方法

1.2.1 氣道基底細(xì)胞的分離

氣道基底細(xì)胞的分離、傳代和保存各項(xiàng)操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1)Purecol包被培養(yǎng)瓶。5mL 無菌0.01 mol/L HCl加入15 mg PureCol?(15 mg/瓶),充分溶解。每個(gè)T75培養(yǎng)瓶需要100μL Purecol+7mL無菌PBS,充分鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。每個(gè)T175需要200μL Purecol+14mL無菌PBS,充分鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。停留1 h后,棄去Purecol溶液,UV 光照15～30 min。包被好的培養(yǎng)瓶放入4 ℃冰箱保存。

2)配備沖洗液、消化液、松解液。沖洗液為含0.2%(v/v)青霉素/鏈霉素和500 ng/mL 慶大霉素的谷氨酰胺DMEM 培養(yǎng)液。消化液為含1%(v/v)Protease XIV 和10μg/mL DNase的PBS,配置后需0.2μm 過濾器過濾。松解液含0.5 mg/mL DTT、0.25 mg/mL 膠原酶P、10μg/mL DNase的PBS,配置后需0.2μm 過濾器過濾。以上溶液均保存于4 ℃冰箱。

3)配置培養(yǎng)基。EpiX Base培養(yǎng)液500mL 加入1%(v/v)的P/S 5mL、5%(v/v)的慶大霉素5mL 和Amphotericin B 500μL。Ham's F-12 Nutrient Mix培養(yǎng)液加入100μg/mL 的美羅培南、20 μg/mL的萬古霉素、250 ng/mL的兩性霉素B。

4)氣管和支氣管組織的消化。第1天進(jìn)行氣管和支氣管組織的消化。提前配備沖洗液和消化液。首先,用無菌鑷將標(biāo)本從含抗生素的PBS保存液中取出,置于無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿中注入30mL無菌乳酸林格氏液。用無菌手術(shù)剪和手術(shù)鑷清除氣管或支氣管周圍的軟組織及淋巴結(jié)組織,同時(shí)清理管腔內(nèi)的血塊和分泌物,最后沿著氣管或支氣管的長(zhǎng)軸剪開(圖1)。如標(biāo)本為氣管,則應(yīng)在氣管膜部沿長(zhǎng)軸剪開。將清理干凈后的標(biāo)本放入15mL/50mL Falcon離心管(根據(jù)標(biāo)本大小選擇),以適量沖洗液反復(fù)沖洗3次,每次1 min,手動(dòng)搖晃試管充分清洗,棄去沖洗液。最后向離心管中加入沖洗液和消化液(比例為8mL∶1mL),放置在搖床上4 ℃消化24 h。

圖1 清理好的氣管標(biāo)本

5)分離并接種氣道基底細(xì)胞。第2天進(jìn)行氣道基底細(xì)胞的分離和接種。向15mL/50mL Falcon離心管中加入與消化液等體積的FBS 終止消化,混勻。將氣管或支氣管組織連同消化液一同倒入無菌培養(yǎng)皿,一手持無菌鑷固定氣管或支氣管,一手持無菌手術(shù)刀輕輕搔刮氣管或支氣管內(nèi)膜,注意一定要?jiǎng)幼鬏p柔,同時(shí)應(yīng)沿不同方向充分搔刮。肉眼可看到刮下的細(xì)小的碎片。將培養(yǎng)皿中的溶液回收至15mL/50mL Falcon離心管,并用適量沖洗液反復(fù)沖洗組織2～3次,回收沖洗液至上述離心管。1 000～1 100 r/min離心5 min。棄去上清液,以1mL松解液重懸細(xì)胞沉淀,注意不要使用移液管吹打,僅以手輕輕拍打震蕩離心管使細(xì)胞重懸。將離心管置于37 ℃5%(v/v)的CO2溫箱中孵育10 min,期間應(yīng)取出離心管拍打震蕩2～3次。在此過程中肉眼可見較大塊的細(xì)胞沉淀被溶解,離心管內(nèi)細(xì)胞懸液更均勻。

向離心管中加入與松解液等體積的FBS終止消化,然后加入適量沖洗液;再次1 000～1 100 r/min離心5 min;棄去上清液,以1mL EpiX Base培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。此時(shí)可使用移液管吹打混勻,但動(dòng)作應(yīng)非常輕柔。最后,將細(xì)胞接種于Purecol包被的T75或T175長(zhǎng)頸培養(yǎng)瓶。

1.2.2 氣道基底細(xì)胞的傳代

細(xì)胞融合度80%左右時(shí)可進(jìn)行傳代。具體方法為:棄去培養(yǎng)液,向培養(yǎng)瓶中加入0.05%的胰蛋白酶-EDTA(T175 4mL,T75 2mL);置于37 ℃5%CO2溫箱中孵育1 min;離心管內(nèi)預(yù)先放入1mL FBS,使用細(xì)胞刮輕柔地將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁刮下,收集在離心管內(nèi)。重復(fù)上述過程,充分收集瓶?jī)?nèi)細(xì)胞。向離心管中加入含抗生素的Ham's F-12 Nutrient Mix培養(yǎng)液30mL,1 000～1 100 r/min離心5 min。以1mL EpiX Base培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種于Purecol包被的培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 氣道基底細(xì)胞的保存

收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),保存于10%(v/v)的DMSO 和90%(v/v)的FBS中。通常1×106的細(xì)胞保存于1mL體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO90%(v/v)的FBS中。將細(xì)胞凍存管放置于Mr Froster內(nèi)-80℃冷凍24 h,然后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

1.2.4 氣道基底細(xì)胞免疫熒光染色

接種3×104細(xì)胞于腔室載玻片(Nunc?Lab-Tek ⅡCC2 Chamber Slide),待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。2mL PBS漂洗。加2%(v/v)的多聚甲醛1mL固定細(xì)胞,室溫下靜置10 min,吸去2%多聚甲醛。2mL PBS漂洗1次。如不立即進(jìn)行染色,加入2mLPBS放入4 ℃冰箱保存。

染色前去除玻片上的隔室。加0.3%(v/v)的Triton X-1001h破膜透化細(xì)胞。以含0.5%(v/v)的BSAPBS(PBB)漂洗3次,每次5 min。5%(v/v)的山羊血清(和二抗來源物種相同,溶解于PBB)200 μL室溫下封閉45 min。PBB 漂洗3 次,每次5 min。設(shè)陰性對(duì)照。加100μL 一抗P63(1∶800)、一抗KRT5(1∶1 000)(均溶于PBB)。(如兩種一抗同時(shí)加,需注意抗體來源物種應(yīng)不同,避免一抗和熒光團(tuán)直接結(jié)合),4 ℃孵育過夜,為避免玻片干燥可將玻片放置在有水的暗盒內(nèi)。PBB 漂洗3次,每次5 min。加100μL 二抗Goat anti-Rabbit IgGCy3(1∶200)、二抗Goat anti Mouse IgG-Cy5(1∶200),陰性對(duì)照Alexa Fluor 647 Goat anti-Rabbit(1∶200)(均溶于PBB)。室溫孵育1 h。PBB漂洗3次,每次5 min。PBS漂洗3次。加DAPI復(fù)染細(xì)胞核,封片,熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.5 氣道基底細(xì)胞活性檢測(cè)

將收集到的細(xì)胞重懸于FBS中,充分混勻。取上述細(xì)胞懸液11μL 在1.5mL Eppendorf離心管內(nèi),加等體積(11μL)AO/PI染液,充分混勻。取20 μL上述細(xì)胞懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)?；罴?xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光,死細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的兩樣本間的均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人氣道基底細(xì)胞的鏡下細(xì)胞形態(tài)

顯微鏡下細(xì)胞呈多邊形成片連接,形似蜂巢,細(xì)胞間連接緊密。成熟細(xì)胞形態(tài)較均一,細(xì)胞核大,胞漿內(nèi)可見顆粒。不成熟的細(xì)胞個(gè)體較大,胞漿及細(xì)胞核內(nèi)可見空泡,隨著細(xì)胞成熟空泡消失。圖2A中細(xì)胞為第1代,融合度約80%,細(xì)胞形態(tài)較均一,無其他形態(tài)的細(xì)胞混雜。圖2B圖中箭頭所示細(xì)胞體積較大,胞漿及細(xì)胞核內(nèi)可見空泡。

圖2 氣道基底細(xì)胞的形態(tài)

2.2 人氣道基底細(xì)胞免疫熒光染色

KRT-5和P63是氣道基底細(xì)胞的標(biāo)記物。通過上述方法得到的人氣道基底細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,圖3A 中藍(lán)色為細(xì)胞核,綠色熒光為KRT-5抗體標(biāo)記。圖3B中白色熒光為P63抗體標(biāo)記。通過免疫熒光染色證實(shí)了為氣道基底細(xì)胞。

圖3 免疫熒光染色的人氣道基底細(xì)胞

2.3 人氣道基底細(xì)胞第1代活性檢測(cè)及數(shù)量

自2018年10月至今共成功分離培養(yǎng)38株人原代基底細(xì)胞。標(biāo)本來源宿主中男性21 名、女性17名,年齡中位數(shù)59歲(2,77)。其中健康捐獻(xiàn)者12例,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者11例,特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者9例,系統(tǒng)性硬化肺纖維化3例,朗罕氏細(xì)胞增生癥1例,塵肺病1例,特發(fā)性肺高壓1例。38株人氣道基底細(xì)胞第1代細(xì)胞活性為81.25%±0.12%。表1顯示了健康捐獻(xiàn)者和各種疾病來源的人氣道基底細(xì)胞第1代細(xì)胞活性。健康捐獻(xiàn)者年齡中位數(shù)為35歲,非健康捐獻(xiàn)者年齡中位數(shù)為60歲。健康捐獻(xiàn)者細(xì)胞株細(xì)胞活性平均值為82.15%±0.09%,非健康捐獻(xiàn)者細(xì)胞株細(xì)胞活性平均值為77.84%±0.13%,兩者相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.318,P=0.75)。

表1 人氣道基底細(xì)胞株來源及第1代細(xì)胞活性

自氣道標(biāo)本分離出基底細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),為第0代,經(jīng)1次傳代后為第1代(圖4)。由于氣道基底細(xì)胞具有分化的能力,通常將第1代基底細(xì)胞冷凍保存。38株人氣道基底細(xì)胞第一代細(xì)胞的數(shù)量中位數(shù)為6.0×106;來自于健康捐獻(xiàn)者的12株第一代細(xì)胞數(shù)量的中位數(shù)為1.1×107;慢性阻塞性肺疾病組11株中位數(shù)為6.0×106;特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化組9株中位數(shù)為3.5×106;其他疾病組6株中位數(shù)為4.0×106。

圖4 人氣道基底細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代

3 討論

肺組織具有一定的再生能力,肺上皮受到損傷后,肺干細(xì)胞可進(jìn)行自我更新和損傷修復(fù)來維持和恢復(fù)上皮細(xì)胞的數(shù)量和功能。目前已知內(nèi)源性肺干細(xì)胞包括基底細(xì)胞、氣道分泌性Club細(xì)胞(以往稱為Clara細(xì)胞)、支氣管肺泡干細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞等。在人肺中,Trp63+Krt5+基底細(xì)胞存在于氣管至直徑1 mm 的細(xì)支氣管。由于正常肺組織間散布著增生區(qū)域和轉(zhuǎn)化區(qū)域,即使是在正常捐獻(xiàn)者的肺組織中,在不同個(gè)體之間和同一個(gè)體內(nèi)部,基底細(xì)胞的數(shù)量和分布也存在差異[4]。雖然不能對(duì)人的氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行基因追蹤,但是通過對(duì)攜帶有線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因突變的細(xì)胞集落的大小和組成進(jìn)行分析可作為基因追蹤的替代方法[5]。研究結(jié)果提示基底細(xì)胞中存在多能干細(xì)胞可以隨機(jī)分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞,維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。可利用鼻腔上皮細(xì)胞、較大的氣道標(biāo)本和支氣管刷檢標(biāo)本進(jìn)行基底細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。Trp63+Krt5+基底細(xì)胞最有效的擴(kuò)增傳代方法是在Rho激酶抑制劑Y-27632存在的條件下,在輻照過的3T3-J2鼠成纖維細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)[6],或者與Rho激酶抑制劑,通過BMP和TGFβ信號(hào)通路的Smad依賴信號(hào)抑制劑和Wnt信號(hào)激活劑一起培養(yǎng)[7]。

以本方案分離和培養(yǎng)人氣道基底細(xì)胞成功率高,細(xì)胞純度高,細(xì)胞活性也較高。但也存在以下常見問題:①細(xì)胞非常敏感,本試驗(yàn)中來自于健康捐獻(xiàn)者、COPD 和其他疾病患者的細(xì)胞株的第一代細(xì)胞中均存在細(xì)胞數(shù)量較少的情況。在分離過程中應(yīng)注意操作需非常輕柔,離心時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照方案來設(shè)定轉(zhuǎn)速和時(shí)間,減少細(xì)胞損傷。②由于氣道標(biāo)本并非為無菌狀態(tài),尤其是慢性阻塞性肺疾病患者來源的標(biāo)本合并感染的幾率較高,因此即使在保存液和培養(yǎng)液中添加抗生素,在分離和培養(yǎng)氣道基底的細(xì)胞的過程中發(fā)生污染也非常常見。氣管或支氣管組織自肺組織分離后,保存在添加有美羅培南、萬古霉素和兩性霉素B的PBS中。由于細(xì)胞很敏感,培養(yǎng)液中添加更多種的抗生素不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。為減少細(xì)胞被污染的幾率,在細(xì)胞接種的前3 d,可將培養(yǎng)液中的兩性霉素B濃度提高至1 500μg/mL。如發(fā)生細(xì)胞污染,可參考標(biāo)本來源宿主的臨床信息,比如肺部感染的病原菌和藥敏結(jié)果在培養(yǎng)液中添加敏感抗生素進(jìn)行挽救。③本文所用方法分離和培養(yǎng)的氣道基底細(xì)胞形態(tài)較為均一,純度較高,但有時(shí)可能混雜有肺成纖維細(xì)胞。肺成纖維細(xì)胞鏡下呈梭形外觀,有偽足樣突起。為盡量減少其他類型混雜的可能性,在使用刀片搔刮氣管或支氣管內(nèi)膜時(shí)應(yīng)力度輕柔,避免破壞內(nèi)膜基底層。

成功分離人氣道基底細(xì)胞是進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)。目前的研究熱點(diǎn)之一是利用氣道基底細(xì)胞體外構(gòu)建3D 肺類器官,從而進(jìn)行肺的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制,以及哮喘和囊性纖維化疾病治療等方面的研究[8-10]。