張慧瑩 楊為喬 陳 瑤 黎 攀,2 杜 冰,2

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

雞內(nèi)金為雉科動(dòng)物家雞(Gallus gallus domesticus Brisson)的干燥沙囊內(nèi)壁，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，表述為上品丹雄雞項(xiàng)下[1]，于2002年被國家衛(wèi)生計(jì)生委收錄于“既是食品又是藥品的物品名單”的藥食同源名單中[2]，具有降血脂[3-4]、保護(hù)心臟[5]、健胃消食[6]、增強(qiáng)腸道屏障功能[7]等功效。近年來，有關(guān)生物酶解制取多肽的研究越來越多，其效率高、污染低，而且酶解產(chǎn)物包含許多人體必需氨基酸。另一方面，通過酶解可以得到具有抗氧化活性、緩解疲勞和降血壓等功能性的更利于人體吸收的小分子多肽[8-9]。但目前有關(guān)雞內(nèi)金酶解及酶解產(chǎn)物的研究較少[10]。研究擬利用中性蛋白酶及堿性蛋白酶對雞內(nèi)金進(jìn)行酶解，探究雞內(nèi)金的最佳酶解工藝和酶解物的相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成和抗氧化活性，以期為雞內(nèi)金的進(jìn)一步開發(fā)利用及雞內(nèi)金多肽的分離純化與功能開發(fā)等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干雞內(nèi)金：市售；

氫氧化鈉、五水合硫酸銅、四水合酒石酸鉀鈉、甲醛、二水合5-磺基水楊酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

三氯乙酸：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

杜馬斯快速定氮分析儀：rapid N exceed型，德國元素Elementar公司；

全自動(dòng)氨基酸分析儀：S-433D型，賽卡姆公司；

全自動(dòng)氨基酸分析儀：日立L-8900型，日立高新技術(shù)公司；

筆式酸度計(jì)：PHB-3型，上海悅豐儀器儀表有限公司；

磁力攪拌器：85-2WS型，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；

數(shù)顯恒溫循環(huán)水箱：HH-420型，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞內(nèi)金基本成分分析

(1) 粗多糖含量：按SN/T 4260—2015執(zhí)行。

(2) 粗脂肪含量：按GB 5009.6—2016執(zhí)行。

(3) 蛋白質(zhì)含量：按GB 5009.5—2016執(zhí)行。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 將干燥雞內(nèi)金粉碎過60目篩，稱取一定量的雞內(nèi)金粉末，以中性蛋白酶添加量為0.5%和堿性蛋白酶添加量為1.5%作為單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件，分別對酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間和蒸煮時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析，以雞內(nèi)金多肽得率及水解度(以干重計(jì))為衡量指標(biāo)。

(1) 蒸煮時(shí)間：固定酶解pH為8，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，100 ℃滅酶10 min，考察蒸煮時(shí)間(2，3，4，5，6 h)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

(2) 酶解pH：固定蒸煮時(shí)間4 h，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間6 h，100 ℃滅酶10 min，考察酶解pH(7，8，9，10，11)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

(3) 酶解時(shí)間：固定蒸煮時(shí)間4 h，酶解pH為8，酶解溫度50 ℃，100 ℃滅酶10 min，考察酶解時(shí)間(5，6，7，8，9 h)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

(4) 酶解溫度：固定蒸煮時(shí)間4 h，酶解pH為8，酶解時(shí)間6 h，100 ℃滅酶10 min，考察酶解溫度(45，50，55，60，65 ℃)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水解度及多肽得率為衡量指標(biāo)，選取酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值和蒸煮時(shí)間為影響因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

1.2.4 水解度測定 參照馮倩等[8]的方法并修改。先測定雞內(nèi)金總氮含量；再測定酶解液中游離氨基酸態(tài)氮(CN)含量，并按式(1)計(jì)算水解度。

DH=CN×V/N×100%，

(1)

式中：

DH——水解度，%；

CN——酶解液中游離氨基酸態(tài)氮含量，g/mL；

N——總氮含量，g；

V——酶解液總體積，mL。

1.2.5 多肽含量測定 參照馮倩等[8]的方法。

1.2.6 氨基酸組成分析

(1) 水解氨基酸：參照GB 5009.124—2016并修改。準(zhǔn)確稱取0.050 0 g雞內(nèi)金粉末及0.030 0 g雞內(nèi)金酶解物，分別加入10 mL鹽酸溶液(6 mol/L)，充入氮?dú)猓?10 ℃ 電熱鼓風(fēng)恒溫箱中水解23 h，過濾，取1 mL濾液，56 ℃水浴蒸干，再加入1 mL一級水，蒸干，重復(fù)兩次。徹底蒸干后加入4 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 2.2)，振蕩混勻，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣進(jìn)行氨基酸自動(dòng)分析儀分析。

(2) 游離氨基酸：準(zhǔn)確稱取1 g雞內(nèi)金粉末，加入3 mL 5%磺基水楊酸研磨30 min，靜置2 h，離心，上清液過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣進(jìn)行氨基酸自動(dòng)分析儀分析。

1.2.7 多肽相對分子質(zhì)量分布測定 參照朱翰林等[11]的方法。色譜柱為TOSOH TSKgel G2000SWXL凝膠柱，流動(dòng)相為乙腈—水溶液(V水∶V乙腈=80∶20，內(nèi)含0.1% 的三氟乙酸)，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量5 μL(質(zhì)量濃度1 g/L)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長220 nm。

1.2.8 多肽抗氧化性測定 按GB/T 39100—2020執(zhí)行。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分

由表1可知，雞內(nèi)金營養(yǎng)成分組成絕大部分為蛋白質(zhì)，其含量(干基)高達(dá)97.54%，多糖、脂肪等營養(yǎng)成分含量低，除雜工序簡單，且雞內(nèi)金作為一種畜產(chǎn)品加工的副產(chǎn)品，具有便宜易得的特點(diǎn)，是一種理想的酶解原料?；诮?jīng)濟(jì)效益和時(shí)間考慮，采用無需預(yù)先進(jìn)行脫脂、脫糖處理，直接進(jìn)行酶解的試驗(yàn)方法。

表1 雞內(nèi)金的基本成分Table 1 Basic composition of galli gigerii endothelium corneum %

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 蒸煮時(shí)間對水解度及多肽得率的影響 由圖1可知，隨著蒸煮時(shí)間的延長，雞內(nèi)金水解度逐漸增大，雞內(nèi)金多肽得率則先增大后趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)槊附馇斑M(jìn)行高溫蒸煮會(huì)破壞雞內(nèi)金的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得更多酶作用位點(diǎn)暴露出來，有利于蛋白質(zhì)肽鍵的斷裂和酶解反應(yīng)的進(jìn)行，在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)延長蒸煮時(shí)間有利于提高水解度和多肽得率，當(dāng)水解度和多肽得率達(dá)到最大值時(shí)，由于底物有限，水解度和多肽得率便不再增加[12]。綜合分析，選擇蒸煮時(shí)間4，5，6 h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 蒸煮時(shí)間對水解度及多肽得率的影響Figure 1 Effect of cooking time on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.2 酶解pH對水解度及多肽得率的影響 由圖2可知，隨著pH值的增大，雞內(nèi)金水解度先增加后趨于平穩(wěn)，多肽得率先增加后降低。當(dāng)酶解pH值為10時(shí)，多肽得率最高為61.27%。多肽得率降低可能是因?yàn)樵诿附鈖H值>10時(shí)，將大分子蛋白酶解為由3個(gè)或3個(gè)以上氨基酸組成的多肽的酶在非最適pH值環(huán)境下活性減弱[8]。綜合考慮，選擇酶解pH值為9，10，11作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 酶解pH值對水解度及多肽得率的影響Figure 2 Effect of the pH value of enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.3 酶解時(shí)間對水解度及多肽得率的影響 由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，雞內(nèi)金水解度先增加后趨于平穩(wěn)，多肽得率先增加后下降，當(dāng)酶解時(shí)間為8 h時(shí)，多肽得率最高。當(dāng)酶解時(shí)間>8 h時(shí)，多肽得率開始下降，可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長，多肽被進(jìn)一步酶解成二肽或少部分的游離氨基酸[13-14]，無法被雙縮脲法檢測出來。綜合考慮，采用酶解時(shí)間7，8，9 h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 酶解時(shí)間對水解度及多肽得率的影響Figure 3 Effect of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.4 酶解溫度對水解度及多肽得率的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的增加，雞內(nèi)金水解度和多肽得率均先增加后降低。當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最高為10.67%，當(dāng)酶解溫度為60 ℃時(shí)，多肽得率達(dá)到最高為55.95%。酶的催化活性受酶解溫度影響較大，當(dāng)雞內(nèi)金酶解溫度超出其最適反應(yīng)溫度范圍，酶活性小，酶解程度低，水解度和多肽得率低[11, 15]。綜合考慮，采用酶解溫度55，60，65 ℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 酶解溫度對水解度及多肽得率的影響Figure 4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on degree of hydrolysis and peptide yield

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值和蒸煮時(shí)間為影響因素，以多肽得率和水解度為響應(yīng)值，采用L9(34)正交試驗(yàn)對雞內(nèi)金酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平表見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factor level of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 3 Orthogonal experimental design and result analysis

由表3可知，各因素對雞內(nèi)金多肽得率影響大小為酶解pH值>酶解時(shí)間>蒸煮時(shí)間>酶解溫度，理論最優(yōu)雞內(nèi)金酶解工藝組合為A2B3C3D3；各因素對雞內(nèi)金水解度影響大小為酶解pH值>蒸煮時(shí)間>酶解時(shí)間>酶解溫度，理論最優(yōu)雞內(nèi)金酶解工藝組合為A2B1C3D3及A2B3C3D3。從多肽得率和水解度兩方面綜合考慮，確定A2B3C3D3為最優(yōu)雞內(nèi)金酶解工藝，即酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間9 h，酶解pH值11，蒸煮時(shí)間6 h。該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，得到雞內(nèi)金多肽得率為75.68%，水解度為14.43%。

2.4 雞內(nèi)金及其酶解物氨基酸組成分析

由表4可知，雞內(nèi)金酶解后，大部分氨基酸含量略微減少，是因?yàn)樵趬A性條件下進(jìn)行酶解，除色氨酸外，絕大部分氨基酸都會(huì)受到不同程度的破壞。但雞內(nèi)金與雞內(nèi)金酶解物的17種氨基酸及不同呈味特征氨基酸的占比相差無幾，含量最豐富的5種氨基酸均為谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，與李澤鴻等[16]的結(jié)果較為相似，說明堿性蛋白酶與中性蛋白酶共同酶解較好地保留了雞內(nèi)金的氨基酸多樣性。雞內(nèi)金與雞內(nèi)金酶解物的必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)分別為57.02%，58.56%，均高于FAO/WHO的比值(40%)[8]，說明雞內(nèi)金和雞內(nèi)金酶解物含有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

表4 氨基酸組成分析Table 4 Analysis of amino acid composition

由表5可知，甲硫氨酸RC值最低，RC值>1表示該氨基酸相對過剩，RC值<1表示該氨基酸相對不足，RC值最小的氨基酸為限制氨基酸，故甲硫氨酸為二者的限制性氨基酸[17]。

表5 各種必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、比值系數(shù)(RC)及比值系數(shù)分(SRC)Table 5 RAA, RC and SRC of human essential amino acids

2.5 雞內(nèi)金酶解物相對分子質(zhì)量分布

由圖5和表6可知，雞內(nèi)金酶解物的數(shù)均分子量為108.50 Da，重均分子量為376.63 Da，峰位分子量為103.95 Da，平均分子量為1 057.4 Da。其中，相對分子質(zhì)量<1 000 Da的酶解物所占比例為90.2%，相對分子質(zhì)量為1 000～2 000 Da的酶解物所占比例為7.9%，相對分子質(zhì)量為2 000～5 000 Da的酶解物所占比例為1.9%。說明酶解后，絕大部分難溶的大分子雞內(nèi)金蛋白被酶解成易溶于水的小分子多肽，更加有利于消化吸收[18]。

圖5 雞內(nèi)金酶解物分子量分布圖Figure 5 Molecular weight distribution diagram of enzymatic hydrolysate of galli gigerii endothelium corneum

2.6 雞內(nèi)金酶解物的抗氧化性

2.6.1 對DPPH自由基的清除能力 由圖6可知，在0～10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著雞內(nèi)金酶解物質(zhì)量濃度的提高，DPPH自由基清除率也隨之提高。與谷胱甘肽相比，雞內(nèi)金酶解物的DPPH自由基清除效果較差，但與南極磷蝦多肽[19]和烏賊墨多肽[20]的效果相當(dāng)，說明雞內(nèi)金酶解物仍具有一定的抗氧化活性，能在一定程度上減輕機(jī)體的氧化損傷。

圖6 雞內(nèi)金酶解物對DPPH自由基的清除能力Figure 6 Scavenging ability of enzymatic hydrolysis products of galli gigerii endothelium corneum on DPPH free radicals

2.6.2 對ABTS+自由基的清除能力 由圖7可知，在0～10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著雞內(nèi)金酶解物質(zhì)量濃度的提高，ABTS+自由基清除率也隨之提高，且在1.5 mg/mL 質(zhì)量濃度時(shí)，雞內(nèi)金酶解物對ABTS+自由基的清除率達(dá)(94.19±0.26)%，與谷胱甘肽的最大清除率相近，且與南極磷蝦多肽[19]和烏賊墨多肽[20]相比，雞內(nèi)金酶解物具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，說明雞內(nèi)金酶解物可能是多肽類抗氧化劑的良好來源。

圖7 雞內(nèi)金酶解物對ABTS+自由基的清除能力Figure 7 Scavenging ability of enzymatic hydrolysis products of galli gigerii endothelium corneum on ABTS+ free radicals

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，雞內(nèi)金的最佳酶解工藝條件為利用中性蛋白酶和堿性蛋白酶共同酶解，酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間9 h，酶解pH值11，蒸煮時(shí)間6 h，此條件下雞內(nèi)金多肽得率為75.68%，水解度為14.43%；該酶解工藝較好地保留了雞內(nèi)金氨基酸的多樣性和營養(yǎng)價(jià)值，氨基酸組成與酶解前相差無幾，相對分子質(zhì)量<1 000 Da的酶解物所占比例為90.2%，使得雞內(nèi)金更易被人體消化吸收利用；此外，采用該工藝制備的雞內(nèi)金酶解物還具有一定的抗氧化活性。后續(xù)可分析酶解物中具體類別的多肽、單一多肽的提純及特異生理功能。