周自廣

瘢痕疙瘩是一種以纖維增生為特征的皮膚病，通常難以治愈，如果治療不當(dāng)，會導(dǎo)致病人出現(xiàn)嚴(yán)重的情緒和身體痛苦；其手術(shù)切除極易復(fù)發(fā)，現(xiàn)在多用藥物進行治療［1］。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts，KF）的異常增殖和凋亡是導(dǎo)致瘢痕疙瘩的主要原因［2］。研究表明中藥可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，有效防治瘢痕疙瘩［3］。人參皂苷有多種有效單體成分，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1 能抑制活性細(xì)胞增殖，血管生成減少，膠原合成減少，有效改善兔耳瘢痕的增生［4］。人參皂苷R3 可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，抑制病理學(xué)瘢痕的形成［5］。人參皂苷Rh2 能抑制肝癌細(xì)胞生長并促進其凋亡［6］。而人參皂苷Rh2對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響及其機制尚不清楚。miRNA 在瘢痕疙瘩的發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p 對胃癌細(xì)胞增殖［8］、結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［9］具有抑制作用，還能促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［9］。然而miR-133a-3p 對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響也不清楚。本研究自2019年3—9月研究人參皂苷Rh2和miR-133a-3p對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料人參皂苷Rh2 購自西安瑞林生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema 公司；miScript Reverse Transcription Ⅱ試劑盒購自上海Qiagen；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒購自江蘇Beyotime Biotechnology；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）試劑盒購自北京Solarbio 公司；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)無菌條件下將手術(shù)切除的人瘢痕疙瘩組織去除表皮及脂肪組織，用含100 U/mL 青霉素和100 g/L 鏈霉素的PBS洗滌3次，剪碎成組織微粒，后用DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃，含5%二氧化碳恒溫箱培養(yǎng)，每2～3天換液一次，1 周后在顯微鏡下觀察，待組織微粒周圍有梭形細(xì)胞游出后，吸去組織塊和培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，用蘇木精-伊紅染色鑒定確為瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后繼續(xù)繼代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組取對數(shù)生長期KF，分別用濃度為50、100、200 mg/L的人參皂苷Rh2培養(yǎng)，未給人參皂苷Rh2 記為對照（NC）組；將miR-NC、miR-133a-3p 分別轉(zhuǎn)染至KF 中記為miR-NC 組、miR-133a-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-133a-3p分別轉(zhuǎn)染至KF 再用200 mg/L 的人參皂苷Rh2處理記為anti-miR-NC+人參皂苷Rh2 組、anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2組。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/PI 試劑盒用于檢測KF 凋亡。各組KF 在25 ℃的黑暗環(huán)境中用Annexin V-FITC 和PI 染色10 min。在FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測miR-133a-3p表達(dá)水平各組KF 培養(yǎng)48 h 后提取細(xì)胞總RNA，在RNA 被miScript Reverse Transcription Ⅱ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后，miRNA qRT-PCR 試劑盒用于測量miR-133a-3p 表達(dá)，PCR擴增反應(yīng)在95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，40 cycles；60 ℃延長5 min的循環(huán)條件下進行。采用2-△△Ct法計算結(jié)果。引物序列為（5'-3'）：miR-133a-3p 正向：ACACTCCAGCTGGGTTGGTCCCCTTCAACC，反向：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACA；U6（內(nèi)參）正向：CTCGCTTCGGCAGCACA， 反向 ： AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）、β-連環(huán)素（β-catenin）蛋白表達(dá)各組KF 培養(yǎng)48 h后，將RIPA 裂解溶液在冰上裂解KF 20 min。使用BCA 試劑盒測量樣品蛋白質(zhì)濃度水平。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后立即將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在25℃下，將蛋白與5%脫脂奶粉一起孵育1 h，在4 ℃下，使用一抗（1∶1 000）孵育蛋白12 h，然后與二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，用ECL 發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One 凝膠分析以β 肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參分析蛋白條帶的灰度以檢測表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0 分析，計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人參皂苷Rh2對KF凋亡的影響與對照組相比，50、100、200 mg/L 的人參皂苷Rh2培養(yǎng)KF 中細(xì)胞凋亡率升高［（9.08±0.91）%、（16.28±1.63）%、（23.18±2.32）%比（4.29±0.43）%，P＜0.05］。

2.2 人參皂苷Rh2 對miR-133a-3p 表達(dá)的影響與對照組（1.00±0.10）相比，200 mg/L 人參皂苷Rh2組miR-133a-3p 表達(dá)水平（3.64±0.36）升高（t=12.24，P＜0.05）。

2.3 高表達(dá)miR-133a-3p 對KF 凋亡的影響 miR-133a-3p組KF中miR-133a-3p表達(dá)水平比miR-NC組升高，Cleaved caspase-3 表達(dá)水平也比miR-NC 組升高，細(xì)胞凋亡率比miR-NC 組升高（P＜0.05）。見圖1，表1。

表1 高表達(dá)miR-133a-3p對KF凋亡的影響/±s

表1 高表達(dá)miR-133a-3p對KF凋亡的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。

組別miR-NC miR-133a-3p t值P值重復(fù)次數(shù)33 miR-133a-3p 1.00±0.11 2.76±0.28 10.13 0.001 Cleaved caspase-3 0.32±0.03 0.86±0.09 9.86 0.001凋亡率/%4.37±0.44 15.72±1.57 12.06＜0.001

圖1 Western blotting檢測高表達(dá)miR-133a-3p后Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.4 低表達(dá)miR-133a-3p 可以部分逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rh2 對KF 凋亡的影響與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-133a-3p 組KF 中Cleaved caspase-3 表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2組KF中miR-133a-3p表達(dá)水平比antimiR-NC+人參皂苷Rh2 組降低，Cleaved caspase-3 表達(dá)水平也比anti-miR-NC+人參皂苷Rh2 組降低，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）（圖2，表2）。

表2 低表達(dá)miR-133a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rh2對KF凋亡的影響/±s

表2 低表達(dá)miR-133a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rh2對KF凋亡的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。①與anti-miR-NC比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC+人參皂苷Rh2比較，P＜0.05。

組別anti-miR-NC anti-miR-133a-3p anti-miR-NC+人參皂苷Rh2 anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2 F值P值重復(fù)次數(shù)3333 miR-133a-3p 1.00±0.10 0.30±0.03①0.96±0.10 0.45±0.05②64.94＜0.001 Cleaved caspase-3 0.30±0.03 0.10±0.01①0.98±0.10 0.42±0.04②138.75＜0.001凋亡率/%4.30±0.45 1.01±0.10①23.08±2.31 7.26±0.73②189.54＜0.001

圖2 低表達(dá)miR-133a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rh2對KF中Cleaved caspase-3蛋白的影響

2.5 Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)人參皂苷Rh2 組KF 中β-catenin 表達(dá)水平低于NC 組［（0.38±0.04）比（0.80±0.08），P＜0.05］；anti-miR-133a-3p+人參皂苷Rh2 組KF 中β-catenin 高于antimiR-NC+人參皂苷Rh2 組［（0.71±0.07）比（0.42±0.05），P＜0.05］。見圖3。

圖3 Western blotting檢測β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討論

瘢痕疙瘩的治療選擇范圍廣泛，這些治療方案都有各自優(yōu)勢，但副作用和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險仍然存在［10］。因此，確定用于治療瘢痕疙瘩的改進的治療方法或藥物是緊迫且非常重要的。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3 處理后，KF 的增殖、遷移、侵襲、血管生成和膠原合成受到顯著抑制，人參皂苷Rg3 可作為治療瘢痕疙瘩病人的可靠藥物［11］。人參皂苷Rg1能抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖，減少高糖培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞膠原和TGF-β1的分泌，抑制Wnt信號通路的異常表達(dá)［12］。說明人參皂苷具有抑制瘢痕形成的作用，且可能與部分信號通路有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路抑制SHG44 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度人參皂苷Rh2處理的KF中細(xì)胞凋亡率升高。說明人參皂苷Rh2可促進瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，也具有抑制瘢痕形成的作用。

研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-133a-3p 抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進細(xì)胞凋亡［14］。miR-133a-3p 過表達(dá)通過調(diào)控糖原磷酸化酶B（glycogen phosphorylase B，PYGB）/Wnt/β-catenin信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移［15］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-133a-3p，Cleaved caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率升高。說明過表達(dá)miR-133a-3p 可促進瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡。且人參皂苷Rh2培養(yǎng)KF 后，miR-133a-3p表達(dá)增強，人參皂苷Rh2對KF 凋亡的促進作用被低表達(dá)miR-133a-3p所部分逆轉(zhuǎn)。表明人參皂苷Rh2 可能通過上調(diào)miR-133a-3p表達(dá)促進瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin 信號通路在細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中起重要作用，β-catenin 是該信號通路發(fā)關(guān)鍵因子，β-catenin 高表達(dá)可激活Wnt/β-catenin 信號通路，進而促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［16］。Wnt/βcatenin 信號通路與病理性瘢痕的形成密切相關(guān)［17］。研究發(fā)現(xiàn)沉默β-catenin 能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并促進其凋亡［18］。本研究數(shù)據(jù)表明，人參皂苷Rh2 處理的KF 中β-catenin 表達(dá)水平降低，低表達(dá)miR-133a-3p 部分逆轉(zhuǎn)了人參皂苷Rh2 對βcatenin 的抑制作用。以上結(jié)果表明，人參皂苷Rh2可抑制Wnt/β-catenin 信號通路激活，其可能是通過調(diào)控miR-133a-3p實現(xiàn)的。

綜上所述，人參皂苷Rh2 可促進瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，其機制可能與miR-133a-3p 和Wnt/βcatenin信號通路有關(guān)。