賀椿媛， 梁金環(huán)， 王 翠， 徐 倩

(滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)教研室， 河北 滄州 061000)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，包括分化型甲狀腺癌(乳頭狀癌、濾泡狀癌)、甲狀腺未分化癌和甲狀腺髓樣癌[1]。近年來，其發(fā)病率逐漸升高，且女性患者居多；臨床治療方法仍以手術(shù)治療為主，放、化療為輔的綜合模式治療，但晚期分化型、未分化型甲狀腺癌對(duì)臨床常用的放化療治療敏感度較差，且對(duì)患者的生存率并無明顯提高[2]，故尋找更佳的治療手段為臨床研究的重點(diǎn)。硼替佐米(Bortezomib)是一種蛋白酶體抑制劑，在治療難治性或復(fù)發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤以及某些實(shí)體腫瘤中具有令人矚目的療效[3]，最近，一項(xiàng)局部晚期或轉(zhuǎn)移性甲狀腺髓樣癌的臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)研究顯示，硼替佐米在治療中具有安全性和耐受性好的特點(diǎn)[4]；體外研究也顯示硼替佐米可誘導(dǎo)TC細(xì)胞凋亡[5]，是尚無確定治療方案的TC患者的一種有前途的治療方法。然而，關(guān)于硼替佐米在甲狀腺癌中的作用的報(bào)道很少。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的激活與甲狀腺腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯密切相關(guān)[6,7]，而硼替佐米可誘導(dǎo)AMPK激活，進(jìn)而誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬[8,9]；硼替佐米對(duì)TC細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用是否與AMPK/mTOR通路有關(guān)還未知，因此本研究以TC細(xì)胞為對(duì)象，探究硼替佐米對(duì)人TC細(xì)胞凋亡、侵襲的影響及潛在的作用機(jī)制；以明確硼替佐米的具體作用機(jī)制，從而為硼替佐米應(yīng)用于甲狀腺癌治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞:人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株B-CPAP(美國(guó)ATCC)購(gòu)自上海子實(shí)生物科技有限公司，貨號(hào)：os100407。在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，每2-3d傳代一次，在細(xì)胞達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器:注射用硼替佐米(萬珂，意大利BSP Pharmaceuticals SRL，分包裝：西安楊森制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20171067)；Compound C(AMPK抑制劑，美國(guó)TargetMo，貨號(hào)：S7840)；AICAR(AMPK激活劑，碧云天生物科技公司，貨號(hào)：S1515)；胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)；人工重構(gòu)基底膜膠(Matrigel)(美國(guó)BD公司，貨號(hào)：356234)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司，貨號(hào)：3413)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購(gòu)自碧云天生物科技公司；AMPK(ab32047)、p-AMPK(ab133448)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab109268)、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)(ab2606)、p-4EBP1(ab278686)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)(ab196495)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspases-3)(ab184787)、E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)(ab133597)、β-連接素(β-catenin)(ab32572)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均購(gòu)自英國(guó)abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；倒置熒光顯微鏡(IX73，日本Olympus公司)；多功能酶標(biāo)儀(iMark680)、流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ)、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1MTT法篩選硼替佐米的實(shí)驗(yàn)濃度及時(shí)間:取指數(shù)增長(zhǎng)期的甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞，以2×103細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔板中(邊緣孔用PBS填充)，待細(xì)胞貼壁并鋪滿孔底后，棄去原培養(yǎng)基，更換含低濃度(2%)血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24h后，加入含不同濃度硼替佐米(0、12.5、25、100、200nmoL/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。然后在各孔中加入5g/L MTT試劑20μL；繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清后加入150μL的DMSO；在490nm處測(cè)定各組細(xì)胞的OD值，將不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，計(jì)算細(xì)胞存活率；并采用GraphPad軟件計(jì)算硼替佐米對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(the half inhibitory concentration,IC50)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD)×100%

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取指數(shù)增長(zhǎng)期的甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞，按每孔2×106個(gè)接種于24孔板，分為對(duì)照組、AICAR組(AMPK激活劑2mmoL/L)[10]、硼替佐米(50nmoL/L)組、硼替佐米+Compound C組(硼替佐米 50nmoL/L+AMPK抑制劑Compound C 5μmoL/L)[7]；給予相應(yīng)的處理后在37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)48h后，胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，EP管中加入100μL單細(xì)胞懸液，然后加入Annexin V-FITC和PI各5μL，避光孵育15min后加入1×Blinding Buffer 400μL，1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞凋亡率。

1.3.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:細(xì)胞按照1.3.2項(xiàng)下操作步驟進(jìn)行分組和培養(yǎng)，取培養(yǎng)48h后的各組B-CPAP細(xì)胞，用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，將Matrigel膠稀釋后加到Transwell上室，風(fēng)干過夜后，分別加入200μL細(xì)胞懸液(無血清)，下室加入400μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出Transwell小室，95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染液染色，ddH2O清洗小室下表面，用濕棉簽小心擦除上室底部膜表面的細(xì)胞。晾干后在顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，拍照；取細(xì)胞穿膜數(shù)，計(jì)算平均值表示細(xì)胞侵襲能力。

1.3.4Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡、侵襲以及AMPK/mTOR/4EBP1通路相關(guān)蛋白的表達(dá):使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞中蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測(cè)量上清液中的總蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品(30μg)上樣，然后在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，并在4℃下與一抗(AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、Bcl-2、Caspases-3、E-cadherin、β-catenin、β-actin)孵育過夜。第2天，洗去一抗，加入二抗(IgG)孵育2h，然后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)進(jìn)行顯色。以β-actin為內(nèi)參，分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1硼替佐米的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)濃度:不同濃度的硼替佐米能不同程度的抑制B-CPAP細(xì)胞的生長(zhǎng)，見表1；不同濃度的硼替佐米在培養(yǎng)24h時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率差異不甚明顯；不同濃度的硼替佐米在培養(yǎng)48h時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率顯著降低，硼替佐米對(duì)B-CPAP細(xì)胞的IC50為53.21nmoL/L，因此，選擇50nmoL/L的硼替佐米作用48h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度和時(shí)間。

表1 硼替佐米對(duì)B-CPAP細(xì)胞活力的影響±s，%，n=3)

2.2各組甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞凋亡率:與對(duì)照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組細(xì)胞凋亡率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；見圖1、表2。

圖1 各組B-CPAP細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

表2 各組B-CPAP細(xì)胞凋亡率的比較±s，%，n=3)

2.3各組甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞侵襲能力:與對(duì)照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞進(jìn)入Transwell小室下層的數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞進(jìn)入Transwell小室下層的數(shù)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組B-CPAP細(xì)胞進(jìn)入Transwell小室下層的數(shù)量明顯增加(P<0.05)；見圖2、表3。

圖2 各組B-CPAP細(xì)胞的侵襲能力

表3 各組B-CPAP細(xì)胞侵襲能力的比較±s，個(gè)，n=3)

2.4各組甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞凋亡、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞Caspases-3、E-cadherin、β-catenin的表達(dá)顯著增加，Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞上述蛋白表達(dá)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組B-CPAP細(xì)胞Caspases-3、E-cadherin、β-catenin的表達(dá)明顯降低，Bcl-2的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；見圖3、表4。

圖3 各組甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞凋亡、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4 各組B-CPAP細(xì)胞凋亡侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)比較±s，個(gè)，n=3)

2.5各組甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相關(guān)蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比，AICAR組和硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞p-AMPK/AMPK的比值顯著增加，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值顯著降低(P<0.05)；與AICAR組相比，硼替佐米組B-CPAP細(xì)胞上述蛋白表達(dá)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與硼替佐米組相比，硼替佐米+Compound C組B-CPAP細(xì)胞p-AMPK/AMPK的比值明顯降低，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值明顯增加(P<0.05)；見圖4、表5。

圖4 各組甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表5 各組B-CPAP細(xì)胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)比較±s，n=3)

3 討 論

硼替佐米是一種人工合成的雙肽基硼酸鹽二肽化合物，具有抗增殖和抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡；已被批準(zhǔn)用于難治性/復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的治療。羅雨等[11]發(fā)現(xiàn)硼替佐米可抑制甲狀腺未分化癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡；Tsumagari等[5]的研究表明硼替佐米和BRAF抑制劑維拉非尼聯(lián)合使用，在體外和體內(nèi)均可誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、G2期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡增加，并使甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)BRAF抑制劑敏感。E-cadherin普遍存在于各類上皮細(xì)胞中，通常與β-catenin形成E-鈣黏附蛋白/連接蛋白復(fù)合體，從而介導(dǎo)上皮細(xì)胞間的黏附。當(dāng)E-cadherin、β-catenin表達(dá)減低或缺失會(huì)使腫瘤細(xì)胞間的黏附性減弱，易于脫離和遷移，侵入周圍組織和血管。本研究結(jié)果顯示，硼替佐米可顯著降低甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞的存活率和Bcl-2的表達(dá)，增加E-cadherin、β-catenin、Caspases-3的表達(dá)，促進(jìn)其凋亡；與以上研究結(jié)果一致，提示硼替佐米具有抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡的作用。

在甲狀腺癌的發(fā)病過程中，某些基因發(fā)生突變或移位、甲基化等異常時(shí)，會(huì)通過激活相關(guān)的信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖或者凋亡，導(dǎo)致癌變。研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌組織中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的陽性率顯著高于癌旁正常組織，且4EBP1、S6K1為mTOR下游信號(hào)分子，在癌組織中異常表達(dá)，提示三者與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[12]。AMPK是細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，除了在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞代謝中起至關(guān)重要的作用外，越來越多的證據(jù)表明，在某些癌癥中，AMPK活性的抑制或喪失可能會(huì)增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的致癌信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，在甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞中p-AMPK/AMPK的比值較低，而使用AMPK的激活劑AICAR可明顯增加p-AMPK/AMPK的比值，促進(jìn)B-CPAP細(xì)胞凋亡。AMPK是mTOR通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑，AMPK的活化可抑制mTOR的激活，進(jìn)而抑制4EBP1磷酸化，從而抑制蛋白質(zhì)合成。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)抑制AMPK/mTOR信號(hào)通路的激活，可增強(qiáng)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖和侵襲；而使用雙重AMPK激活劑/mTOR抑制劑可顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。以上研究表明，AMPK的激活對(duì)抑制甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。而硼替佐米可誘導(dǎo)AMPK磷酸化，并且AMPK敲低減弱了硼替佐米的保護(hù)作用，表明AMPK激活是硼替佐米作用的基礎(chǔ)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)給予硼替佐米干預(yù)后，B-CPAP細(xì)胞中p-AMPK/AMPK的比值明顯增加，p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值降低，而使用AMPK抑制劑Compound C可升高p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1的比值，明顯減弱硼替佐米對(duì)甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞的促凋亡作用，提示硼替佐米可能通過激活A(yù)MPK，抑制mTOR和4EBP1的活化，誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，硼替佐米可抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增殖、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK，抑制mTOR和4EBP1的活化有關(guān)。本研究?jī)H從體外細(xì)胞水平上初步探究了硼替佐米對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細(xì)胞的影響，由于體內(nèi)外腫瘤微環(huán)境存在差異，尚需要進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確硼替佐米對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞的作用；此外，在甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺未分化癌和甲狀腺髓樣癌中硼替佐米是否發(fā)揮同樣的作用，有待研究確認(rèn)。