江 琪,習(xí)一清,魏 蕾
1. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室(武漢 430071)
2. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院甲乳外科(武漢 430071)
乳腺癌(breast cancer)是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,乳腺癌新發(fā)病例數(shù)已超肺癌,位居女性癌癥發(fā)病人數(shù)的首位[1]。2020年,我國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡例數(shù)分別位列第一及第四位,嚴(yán)重威脅女性健康[2]。近幾十年來(lái),盡管包括手術(shù)切除、化放療、靶向治療等在內(nèi)的綜合治療手段有效改善了乳腺癌患者的預(yù)后,但局部進(jìn)展及合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的中位生存期仍然較短(約24個(gè)月)[3],因此加強(qiáng)對(duì)乳腺癌新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的深入探索具有重要的意義。
LncRNA是一類超過(guò)200個(gè)堿基,且?guī)缀鯚o(wú)法編碼蛋白質(zhì)的RNA[4]。LncRNA涉及多種生物事件,并可參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展,是敏感和特定的癌癥生物標(biāo)志物之一[5-8]。根據(jù)鄰近編碼基因的染色體區(qū)域,可將LncRNA分為正義LncRNA、反義LncRNA、雙向LncRNA、內(nèi)含子LncRNA和基因間LncRNA五類[9]。研究表明,越來(lái)越多的反義LncRNA在腫瘤中起調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用[10]。例如,LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)靶向miR-30a/Nanog軸促進(jìn)乳腺腫瘤的發(fā)生[11];LncRNA PCNA-AS1在肝細(xì)胞癌中促進(jìn)細(xì)胞增殖[12];LncRNA AFAP1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中促進(jìn)細(xì)胞遷移[13]等。
LncRNA GATA3-AS1是一種新型反義LncRNA,與T細(xì)胞發(fā)育和分化有關(guān)[14]。GATA3-AS1已被證實(shí)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖和遷移[15],但其在乳腺癌中的作用及其機(jī)制報(bào)道較少,因此本文擬研究GATA3-AS1在乳腺癌中的生物作用并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步探索,為乳腺癌新型生物標(biāo)志物與藥物靶點(diǎn)的探索提供新思路。
通過(guò) UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)和 bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-requete.php)分析多種腫瘤組織和乳腺癌中GATA3-AS1與GATA3的表達(dá)情況,以及不同臨床和病理參數(shù)乳腺癌患者中GATA3-AS1與GATA3的表達(dá)差異。運(yùn)用lncATLAS在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://lncatlas.crg.eu/)預(yù)測(cè)GATA3-AS1的細(xì)胞定位,并通過(guò)starBase數(shù)據(jù)庫(kù)(https://starbase.sysu.edu.cn/)在線預(yù)測(cè)GATA3-AS1與GATA3的表達(dá)相關(guān)性。GATA3-AS1與GATA3的生存分析由Kaplan-Meier Plotter數(shù) 據(jù) 庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast)中提供的乳腺癌數(shù)據(jù)分析獲得。以上結(jié)果均認(rèn)為P<0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
人乳腺上皮細(xì)胞MDA-MB-10A和兩種乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、MCF-7)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。MDAMB-10A細(xì)胞在37℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中添加1%的青霉素和鏈霉素。
1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
特異性shRNA和NC-shRNA購(gòu)于GenePharma公司,使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國(guó))對(duì) MDA-MB-231和 MCF-7細(xì)胞中的LncRNA GATA3-AS1進(jìn)行沉默。
1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)
將細(xì)胞按照每孔2×103個(gè)的密度接種于96孔板,使用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后,每孔中加入10 μL的CCK8試劑(北京莊盟生物),37℃孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm處的吸光度值。
1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)
將細(xì)胞2×105個(gè)/mL接種于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%~90%密度時(shí),使用黃色移液器直線刮擦細(xì)胞,PBS洗滌劃痕處兩次除去漂浮細(xì)胞,于0 h拍攝劃痕寬度,在含5%血清培養(yǎng)基中持續(xù)孵育48 h后,再次拍攝并計(jì)算劃痕寬度及傷口愈合率。
1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)
將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,加入transwell小室(康寧公司)的上腔室,并在transwell下腔室中加入600 μL含1%雙抗和10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后固定細(xì)胞,并用0.5%結(jié)晶紫染色,擦去上腔室內(nèi)部細(xì)胞后,在顯微鏡下計(jì)數(shù)下腔表面的細(xì)胞數(shù)。
1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR
采用TRIzol試劑(Invitrogen,美國(guó))從細(xì)胞中提取總RNA,通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳中28S條帶與18S條帶的比值檢測(cè)RNA的純度和完整性;使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,美國(guó))將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在CFX96 real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR程序;使用10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Bio-Red,美國(guó))、200 nM正向和反向引物、100 ng cDNA模板,用雙蒸餾水使最終反應(yīng)體系為20 μl。PCR條件設(shè)置為:95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,50個(gè)周期。目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法測(cè)定,并以GAPDH為內(nèi)參,每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。其中引物訂購(gòu)于武漢擎科生物公司。
1.2.7 核質(zhì)分離
使用Ambion PARIS?(Thermo)試劑盒,按照說(shuō)明書內(nèi)容從細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)和核RNA,并進(jìn)行純化。使用qRT-PCR檢測(cè)GATA3-AS1的表達(dá)水平。
1.2.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)
首先,使用增強(qiáng)的RIPA裂解緩沖液(北京索拉博)從細(xì)胞中提取總蛋白,用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(上海翊圣生物)對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量;其次,使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),采用濕轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上;再次,使用5%脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉處理,且敷育相應(yīng)的抗體;最后經(jīng)TBST沖洗后,用顯像液顯像。
本研究各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,研究數(shù)據(jù)以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用t檢驗(yàn)和方差分析比較各組數(shù)據(jù)之間的差異,當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
通過(guò)UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GATA3-AS1進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)GATA3-AS1在多種腫瘤組織中存在差異表達(dá)(圖1-A),且相較正常乳腺組織,GATA3-AS1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯升高(圖1-B)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的兩個(gè)GATA3-AS1探針(240192_at和 240827_at),Kaplan-Meier生存曲線提示GATA3-AS1表達(dá)與乳腺癌總生存期顯著負(fù)相關(guān),即高表達(dá)GATA3-AS1的乳腺癌患者預(yù)后較差(圖1-C)。
圖1 GATA3-AS1的表達(dá)水平與預(yù)后分析Figure 1. The relationship between the expression level of GATA3-AS1 and the prognosis of breast cancer
利用bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同臨床和病理參數(shù)乳腺癌患者中GATA3-AS1的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)GATA3-AS1的表達(dá)與乳腺癌患者年齡之間存在顯著相關(guān)性,年齡≤51歲的患者GATA3-AS1表達(dá)水平明顯低于年齡>51歲的患者(圖2-A)。同時(shí),GATA3-AS1的表達(dá)與Scarff-Bloom-Richardson(SBR)等級(jí)(圖2-B)以及P53基因突變(圖2-C)也存在顯著相關(guān)性。此外,GATA3-AS1在人類表皮生長(zhǎng)因子受體2陰性(HER2-)、雌激素受體陽(yáng)性(ER+)和孕激素受體陽(yáng)性(PR+)的乳腺癌患者中表達(dá)量明顯上調(diào)(圖2-D、圖2-E和圖2-F)。相較于基底細(xì)胞樣型(Basallike)和三陰性乳腺癌(TNBC),GATA3-AS1在非基底細(xì)胞樣型和非三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平更高(圖2-G和圖2-H)。綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中GATA3-AS1在乳腺癌各類分子亞型中表達(dá)水平可看出,激素受體A陽(yáng)性(luminal A)乳腺癌GATA3-AS1表達(dá)水平顯著高于其他亞型(圖2-I)。另外,lncATLAS在線數(shù)據(jù)庫(kù)顯示GATA3-AS1在人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中主要分布于細(xì)胞核內(nèi)(圖2-J),表明該LncRNA可能參與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
圖2 bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)于GATA3-AS1的表達(dá)水平與乳腺癌不同臨床病理特征關(guān)系的分析Figure 2. The relationship between the expression level of GATA3-AS1 and different clinicopathological features of breast cancer was analysed via bc-GenExMiner online database
本研究通過(guò)qRT-PCR對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MCF-7)以及正常乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)中GATA3-AS1的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與MCF-10A細(xì)胞相比,GATA3-AS1在MDA-MB-231和MCF-7中顯著高表達(dá)(P<0.001,圖3-A)。核質(zhì)分離提示GATA3-AS1主要位于MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞核內(nèi)(圖3-B),推測(cè)GATA3-AS1可能通過(guò)影響乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外,通過(guò)shRNA獲得低表達(dá)GATA3-AS1的乳腺癌細(xì)胞株,對(duì)該細(xì)胞株的多種生物功能變化進(jìn)行觀察,qRT-PCR證實(shí)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的GATA3-AS1可被shRNA有效沉默(P<0.001),且sh1的沉默效率高于sh2,達(dá)到80%(圖3-C)。因此,本研究使用sh1進(jìn)行后續(xù)體外功能實(shí)驗(yàn)。
圖3 GATA3-AS1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移Figure 3. GATA3-AS1 promotes breast cancer cell proliferation and migration
CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,沉默GATA3-AS1后, MDA-MB-231和MCF-7的增殖速度明顯下降(P<0.001,圖3-D)。后續(xù)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí),沉默GATA3-AS1明顯抑制了乳腺癌細(xì)胞的二維及三維遷移能力(P<0.001,圖3-E、圖3-F)。
starBase和 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)均發(fā)現(xiàn) GATA3-AS1的蛋白編碼基因GATA3在乳腺癌中的表達(dá)與GATA3-AS1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4-A),且GATA3在乳腺癌中表達(dá)水平高于正常乳腺組織(P<0.001,圖4-B)。Kaplan-Meier生存曲線顯示,GATA3的表達(dá)與乳腺癌的總生存期顯著正相關(guān)(圖4-C)。利用bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同臨床和病理參數(shù)的乳腺癌患者GATA3的表達(dá)差異,結(jié)果顯示GATA3在年齡≤51歲的患者中表達(dá)水平明顯低于年齡>51歲者(圖5-A),且與SBR等級(jí)(圖5-B)以及P53基因突變(圖5-C)存在顯著相關(guān)。此外,GATA3在乳腺癌各分子分型上的表達(dá)差異與GATA3-AS1的表達(dá)趨勢(shì)基本一致(圖5-D、圖5-I)。
圖4 與GATA3-AS1表達(dá)相關(guān)基因的預(yù)測(cè)Figure 4. Prediction of genes that associated with GATA3-AS1 expression
圖5 bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GATA3的表達(dá)水平與乳腺癌不同臨床病理特征關(guān)系的分析Figure 5. The relationship between the expression level of GATA3 and different clinicopathological features of breast cancer was analysed via bc-GenExMiner online database
本研究對(duì)GATA3-AS1與其蛋白編碼基因GATA3所表達(dá)的蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默GATA3-AS1后,MDAMB-231和MCF-7細(xì)胞中的GATA3蛋白水平隨之上升(圖6,P<0.01)。
圖6 沉默GATA3-AS1之后GATA3蛋白水平上升Figure 6. The protein level of GATA3 increases after the silencing of GATA3-AS1
LncRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、免疫激活/失活、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。近期研究證實(shí)多種LncRNA參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,如LncRNA HOTAIR通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路,參與乳腺癌組織的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17];LncRNA FGF13-AS1通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞糖酵解和干性特性起腫瘤抑制作用[18]。作為基因反義鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,反義LncRNA也參與了疾病復(fù)雜的病理生理過(guò)程[19]。GATA3-AS1作為一種新型反義LncRNA,在人類CD4+T細(xì)胞亞群中首次被發(fā)現(xiàn)[20]。Zhu等應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)人類膀胱癌組織中的LncRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)GATA3-AS1在膀胱癌組織中顯著上調(diào)[21]。Luo等研究也證實(shí)GATA3-AS1可通過(guò)沉默抑癌基因促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]。
本研究對(duì)乳腺癌細(xì)胞中GATA3-AS1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示相較正常的乳腺細(xì)胞,GATA3-AS1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),GATA3-AS1高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差,推測(cè)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中,GATA3-AS1發(fā)揮促癌作用。bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,GATA3-AS1在非基底細(xì)胞樣型和非三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于基底細(xì)胞樣型和三陰性乳腺癌,而共識(shí)認(rèn)為三陰性乳腺癌往往預(yù)后較差。導(dǎo)致結(jié)果矛盾的原因可能為:首先,在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)GATA3-AS1生存分析的對(duì)象是未分層的全體乳腺癌患者,未對(duì)乳腺癌亞型進(jìn)行分層預(yù)測(cè);其次,不同數(shù)據(jù)庫(kù)間納入的樣本存在差異,結(jié)果不具有嚴(yán)格意義上的可比性;最后,乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受多基因多因素綜合調(diào)控,且不同亞型乳腺癌中,LncRNA發(fā)揮的作用可能不盡相同。盡管如此,上述生物信息學(xué)分析結(jié)果提示GATA3-AS1作為潛在生物標(biāo)志物,在乳腺癌早期預(yù)測(cè)、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估方面具有一定價(jià)值。然而,GATA3-AS1與乳腺癌預(yù)后關(guān)系及其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制,仍需大樣本、分層深入的研究。
本研究還利用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7對(duì)GATA3-AS1進(jìn)行了體外功能實(shí)驗(yàn),下調(diào)GATA3-AS1的表達(dá)抑制了MDA-MB-231和MCF-7的增殖和遷移能力,證實(shí)GATA3-AS1可能在乳腺癌的進(jìn)展中起促癌作用。研究進(jìn)一步對(duì)GATA3-AS1在乳腺癌中發(fā)揮的作用機(jī)制進(jìn)行探討。通過(guò)starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),GATA3-AS1的蛋白編碼基因GATA3在乳腺癌中的表達(dá)與GATA3-AS1呈正相關(guān)。有研究表明,反義LncRNA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與其蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并在一起,可能與mRNA的基因啟動(dòng)子或近端增強(qiáng)子存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,進(jìn)而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[22-24]。
GATA3在淋巴細(xì)胞、乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)耳和甲狀旁腺等多種人體組織中均有表達(dá),且其表達(dá)是這些器官發(fā)育的基礎(chǔ),它的失調(diào)與急性T細(xì)胞淋巴樣白血病、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、感音神經(jīng)性耳聾和甲狀旁腺機(jī)能減退等多種疾病相關(guān)[25]。其中,GATA3的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)已有一定研究基礎(chǔ)。Mehra等報(bào)道了高表達(dá)GATA3患者10年生存率高于低表達(dá)患者(84% vs. 55%),表明低表達(dá)GATA3提示預(yù)后不良[26]。另一項(xiàng)為期10年的隨訪研究發(fā)現(xiàn),與低表達(dá)GATA3腫瘤相比,高表達(dá)GATA3的腫瘤發(fā)生激素?zé)o反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低了近90%,且預(yù)后更好[27]。GATA3作為腫瘤抑制因子[28-29],是GATA3-AS1的蛋白編碼基因,且又與GATA3-AS1共享一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域[30]。此外,核質(zhì)分離證實(shí)GATA3-AS1定位于MDA-MB-231和MCF-7的細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)一步通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí),在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中下調(diào)GATA3-AS1表達(dá)后,GATA3蛋白水平明顯上升,即二者的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。然而,此結(jié)果與starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果相反。究其原因,一方面可能是在運(yùn)用starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)二者表達(dá)量之間關(guān)系時(shí),是在mRNA水平分析獲得,而實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在蛋白水平上實(shí)踐得出,結(jié)果之間可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所致的表達(dá)差異;另一方面,GATA3被認(rèn)為是乳腺建立和發(fā)育過(guò)程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子,在乳腺癌中參與多種分子調(diào)控機(jī)制[31-35],因此GATA3蛋白的表達(dá)受多基因影響,并不一定完全由GATA3-AS1調(diào)控。由此猜測(cè)GATA3-AS1可能通過(guò)抑制其蛋白編碼基因GATA3的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展,可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。
生存分析顯示,高表達(dá)GATA3的乳腺癌患者預(yù)后更好,與既往研究一致。此外,通過(guò)bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同臨床和病理參數(shù)的乳腺癌患者GATA3的表達(dá)差異進(jìn)行分析,結(jié)果顯示具有抑癌作用的GATA3與具有促癌機(jī)制的GATA3-AS1在表達(dá)量方面與乳腺癌患者的臨床病理特征間的相關(guān)性趨勢(shì)十分相似。這是否意味著GATA3-AS1與GATA3之間存在某種平衡,尚有待進(jìn)一步研究。
基于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)可知,GATA3-AS1在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。GATA3-AS1可能通過(guò)抑制其蛋白編碼基因GATA3的表達(dá),參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。