劉媛 劇猛 左蕾 張耀輝 黃毅

2011年世界衛(wèi)生組織發(fā)布了結(jié)核病與糖尿病防治合作框架，對(duì)結(jié)核病與糖尿病進(jìn)行聯(lián)合監(jiān)測(cè)。我國(guó)結(jié)核病與糖尿病共病患者數(shù)量眾多，合并糖尿病的患者更容易出現(xiàn)肺膿腫、液氣胸和胸腔積液[1-2]；而在糖尿病患者中有12.4%合并結(jié)核病[3]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)是通過對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激T細(xì)胞后釋放的γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)進(jìn)行檢測(cè)，判斷是否為結(jié)核感染的檢查方法[4-6]。糖尿病患者因長(zhǎng)期存在高血糖環(huán)境，抑制了T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增，從而降低了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能[7]，進(jìn)而影響T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果。因此，本研究對(duì)結(jié)核性胸膜炎合并或者未合并糖尿病患者的外周血和胸腔積液標(biāo)本分別進(jìn)行T.SPOT.TB檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，試圖闡明T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)合并糖尿病的結(jié)核性胸膜炎患者的實(shí)際診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

2016—2021年因胸腔積液初次在西安市胸科醫(yī)院進(jìn)行治療的患者共計(jì)526例，排除75例非結(jié)核性胸腔積液及7例合并其他免疫疾病的患者，最終納入444例結(jié)核性胸膜炎患者作為研究對(duì)象。依據(jù)是否合并2型糖尿病分為結(jié)核性胸膜炎合并2型糖尿病患者組(合并糖尿病組；116例)及未合并糖尿病的結(jié)核性胸膜炎患者組(非糖尿病組；328例)。

二、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 診斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)核性胸膜炎依據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》中結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，分為：(1)確診患者：胸腔積液或胸膜活檢標(biāo)本培養(yǎng)陽性，菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌，或胸膜活檢組織符合結(jié)核改變[9]；(2)臨床診斷患者：影像學(xué)檢查顯示胸腔積液為滲出液、腺苷脫氨酶升高，同時(shí)具備以下任意一項(xiàng)：①結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗(yàn)中度陽性或強(qiáng)陽性；②γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽性；③結(jié)核分枝桿菌抗體陽性。2型糖尿病診斷依據(jù)2019年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：排除腫瘤患者、近1個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑或存在其他免疫系統(tǒng)疾病的患者。

三、研究方法

兩組患者于入院后抗結(jié)核治療前1周內(nèi)均行外周血及胸腔積液標(biāo)本采集。

1. 胸腔積液獲取方法：采用超聲引導(dǎo)下穿刺置管引流，患者取坐位，不能取坐位者，可取半臥位；常規(guī)消毒穿刺部位，覆蓋消毒洞巾；超聲引導(dǎo)下以2%利多卡因于穿刺點(diǎn)逐層行浸潤(rùn)麻醉；超聲引導(dǎo)下置入穿刺針及導(dǎo)絲，拔出針鞘，置入16 F導(dǎo)管固定引流抽液，留取胸腔積液30～50 ml立即送檢。

2. T-SPOT.TB檢測(cè)試劑：使用英國(guó)Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-SPOT.TB檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)見英國(guó)Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-SPOT.TB試劑盒檢測(cè)說明書及《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》。

3. 外周血標(biāo)本T-SPOT.TB檢測(cè)方法：無菌注射器抽取足量的外周靜脈血，加至含有肝素或檸檬酸鈉抗凝劑的采血管中，用RPMI 1640培養(yǎng)液等體積混勻；按2∶1～3∶1的體積比加在Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上層，以室溫(18～25 ℃)，1000×g離心22 min。用吸液管吸取白色、云霧狀外周血單個(gè)核細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至15 ml尖底離心管中；加入細(xì)胞培養(yǎng)液至10 ml。以600×g離心7 min；棄去上清液，加PRMI 1640培養(yǎng)液至10 ml，以350×g離心7 min；棄去上清液，加PRMI 1640培養(yǎng)液500 μl混勻，隨后取適量混勻的細(xì)胞懸浮液適當(dāng)稀釋后，使用自動(dòng)細(xì)胞記數(shù)儀記錄數(shù)據(jù)。

4. 胸腔積液標(biāo)本T-SPOT.TB檢測(cè)方法：采用超聲引導(dǎo)下胸腔積液置管引流術(shù)，用無菌密閉容器留取患者的新鮮胸腔積液約30～50 ml，每100 ml加2500 IU(約0.4 ml)抗凝并立即混勻。取胸腔積液標(biāo)本10～15 ml放入15 ml離心管中，以700×g離心7 min；倒掉上清液，留沉渣再加入RPMI 1640培養(yǎng)液至10 ml，混勻后用700×g離心7 min；倒掉上清液留沉渣，再加入RPMI 1640培養(yǎng)液500 μl混勻。隨后取適量混勻的細(xì)胞懸浮液適當(dāng)稀釋后，使用自動(dòng)細(xì)胞記數(shù)儀記錄數(shù)據(jù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組患者基本情況

合并糖尿病組與非糖尿病組患者在性別、是否合并肺結(jié)核、合并肺結(jié)核患者的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果、初復(fù)治情況及診斷依據(jù)方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。合并糖尿病組患者年齡高于非糖尿病組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 合并糖尿病組及非糖尿病組患者一般資料及臨床特征的比較

合并糖尿病組患者中，55例胸腔積液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果為陽性，38例通過病理檢查確診；23例臨床診斷患者中，PPD皮膚試驗(yàn)中度或強(qiáng)陽性6例，γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽性5例，結(jié)核分枝桿菌抗體陽性11例，PPD皮膚試驗(yàn)及結(jié)核分枝桿菌抗體陽性1例。非糖尿病組患者中，138例胸腔積液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果為陽性，147例通過病理檢查確診；43例臨床診斷患者中，PPD皮膚試驗(yàn)中度或強(qiáng)陽性13例，γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽性20例，結(jié)核分枝桿菌抗體陽性9例，PPD皮膚試驗(yàn)及結(jié)核分枝桿菌抗體陽性1例。

二、兩組患者T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果比較

合并糖尿病組及非糖尿病組患者外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率分別為46.55%(54/116)和56.10%(184/328)，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.140，P=0.076)；合并糖尿病組及非糖尿病組胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率分別為65.52%(76/116)和88.41%(290/328)，合并糖尿病組明顯低于非糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.025，P<0.001)。合并糖尿病組和非糖尿病組患者胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率均高于外周血，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.845，P=0.028；χ2=12.848，P<0.001)。

討 論

2010年我國(guó)對(duì)糖尿病進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)成年人糖尿病患病率為11.6%，約占全球糖尿病患者總數(shù)的25%[2-3]。在糖尿病患者中，結(jié)核病具有更高的發(fā)病率和患病率，提高結(jié)核病與糖尿病共病的診斷水平是改善預(yù)后至關(guān)重要的一環(huán)。糖尿病患者免疫功能低下，合并結(jié)核病時(shí)，早期臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及影像學(xué)表現(xiàn)均不典型，給結(jié)核病的診斷及治療帶來一定困擾[11]。T-SPOT.TB是采用結(jié)核抗原刺激CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ，通過檢測(cè)IFN-γ水平的變化來判斷有無結(jié)核感染，不易受免疫狀態(tài)影響[12]，具有較高的敏感度，是近年來結(jié)核病免疫學(xué)診斷的重要技術(shù)。因此，為了解合并糖尿病是否影響結(jié)核性胸膜炎患者的IFN-γ水平，本研究通過對(duì)比合并2型糖尿病及未合并2型糖尿病的結(jié)核性胸膜炎患者外周血和胸腔積液T-SPOT.TB檢查結(jié)果，以探討糖尿病對(duì)結(jié)核性胸膜炎外周血及胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果的影響。

本研究結(jié)果顯示，合并糖尿病組及非糖尿病組患者外周血T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽性率分別為46.55%和56.10%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與鄒琳琳和黎友倫[7]、Walsh 等[13]研究結(jié)果一致，認(rèn)為與肺結(jié)核患者相比，肺結(jié)核合并糖尿病患者特異性T淋巴細(xì)胞所釋放的IFN-γ水平未出現(xiàn)明顯變化。而楊牧青等[14]研究認(rèn)為，肺結(jié)核合并2型糖尿病導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ能力減弱，引起外周血標(biāo)本T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率下降，與上述研究觀點(diǎn)不一致。分析兩種不同觀點(diǎn)的原因，主要考慮糖尿病與結(jié)核病的免疫反應(yīng)錯(cuò)綜復(fù)雜，影響因素較多，與兩種疾病病變分型、病程及治療經(jīng)過等都有關(guān)聯(lián)，可能是導(dǎo)致不同文獻(xiàn)研究結(jié)果不一致的原因。因此，針對(duì)以上問題，擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格研究設(shè)計(jì)，采用多種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，對(duì)疾病進(jìn)行分層分析，可能是一種可行的途徑。

周敏等[15]、Zhang等[16]和Barnes等[17]研究了結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液與外周血標(biāo)本T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率的差異，而鄒琳琳和黎友倫[7]、Walsh等[13]、楊牧青等[14]、吳連革[18]研究了肺結(jié)核合并2型糖尿病患者與肺結(jié)核患者外周血標(biāo)本T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率的差異，但均未對(duì)結(jié)核性胸膜炎合并2型糖尿病患者與未合并糖尿病患者的胸腔積液標(biāo)本T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率進(jìn)行對(duì)比。本研究針對(duì)上述研究?jī)?nèi)容進(jìn)行了補(bǔ)充，結(jié)果顯示合并糖尿病組較非糖尿病組胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率低。分析原因可能是由于2型糖尿病患者長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致毛細(xì)血管壁對(duì)水的通透性增加，或抗利尿激素分泌增加引起水潴留[19]，引起胸腔積液量增加，導(dǎo)致胸腔積液內(nèi)特異性T淋巴細(xì)胞濃度降低；另一方面考慮由于T淋巴細(xì)胞環(huán)境發(fā)生了變化，受其因素影響，T細(xì)胞反應(yīng)能力減弱，引起IFN-γ釋放減少，造成T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率下降。然而，這些假設(shè)還缺乏大數(shù)據(jù)、多中心研究證實(shí)，還需隨后進(jìn)一步分析。

本研究還顯示，在合并糖尿病組患者中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率高于外周血標(biāo)本，與周敏等[15]和Zhang等[16]研究結(jié)果一致，原因可能為結(jié)核病灶侵襲胸腔產(chǎn)生胸腔積液時(shí)，特異性T淋巴細(xì)胞增殖并在病灶周圍聚集，易使胸腔積液中特異性T淋巴細(xì)胞濃度高于外周血。同時(shí)Barnes等[17]和史祥等[20]研究結(jié)果表明，與外周血相比，結(jié)核性胸膜炎胸腔積液中存在更多的CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞，因而相應(yīng)的IFN-γ水平升高。因此，對(duì)結(jié)核性胸膜炎合并2型糖尿病患者進(jìn)行胸腔積液和外周血T-SPOT.TB檢測(cè)時(shí)，胸腔積液檢測(cè)陽性率會(huì)更高。

基于以上結(jié)果，本研究認(rèn)為，當(dāng)結(jié)核性胸膜炎合并2型糖尿病時(shí)，胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率降低，但仍高于外周血T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果。因此，當(dāng)2型糖尿病患者懷疑合并結(jié)核性胸膜炎時(shí)，采用胸腔積液進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)，相較于外周血檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)。

本研究的局限性為，對(duì)于其他影響T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率的因素，限于樣本量的限制，未能進(jìn)行分層研究。同時(shí)，本研究部分結(jié)核性胸膜炎患者為臨床診斷患者，可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，今后將考慮擴(kuò)大樣本量行進(jìn)一步研究加以明確。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突