吳明歧 閆世春 劉玉琴 郭鑫 王美杰 田晶 侯紹英

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)患病的重要危險(xiǎn)因素[1]。DM可使PTB的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.5～7.8倍[2-3]，與此同時(shí)，糖尿病并發(fā)肺結(jié)核(DM-PTB)會(huì)增加PTB的治療難度，更易出現(xiàn)不良治療結(jié)局[4]。因此，在DM患者中早期診斷PTB，對于結(jié)核病的防控及后續(xù)的治療具有重要意義。然而，PTB的診斷方法仍有一定局限性，不利于疾病的早期診斷[5-6]。為此，深入探索DM-PTB的發(fā)病機(jī)制，識別特異性的生物分子用于PTB診斷尤為關(guān)鍵。蛋白質(zhì)組學(xué)在篩選生物標(biāo)志物，探尋疾病的發(fā)病機(jī)制方面得到了廣泛應(yīng)用[7]。與傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜的方法相比，基于同位素標(biāo)記的相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有一致率高，標(biāo)記過程簡單、反應(yīng)迅速等特點(diǎn)，并且在檢測前排除血漿中大量高豐度蛋白的遮蔽作用，具有較好的檢測效能[8-9]。因此，筆者采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較DM和DM-PTB患者的血漿蛋白質(zhì)表達(dá)差異，篩選潛在蛋白生物標(biāo)志物，為在DM患者中早期診斷PTB提供思路。

資料和方法

一、研究對象

采用回顧性研究的方法，選取2017年1月至2018年1月于黑龍江省傳染病防治院確診的DM患者(DM組)和具有DM病史且新診斷PTB的患者(DM-PTB組)作為研究對象。其中，DM組16例，DM-PTB組16例；所有研究對象均為漢族。DM診斷參照美國糖尿病協(xié)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[10]，PTB診斷參照《WS 288—2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[11]。排除腫瘤、肝硬化等重病患者；乙型肝炎病毒和HIV感染者；妊娠和哺乳期女性；服用過抗結(jié)核藥物者。采用加入乙二胺四乙酸的抗凝采血管收集研究對象的清晨空腹靜脈血10 ml，4 ℃ 3000×g離心10 min，收集上清液于-80 ℃保存，以備后續(xù)分析。所有研究對象均經(jīng)知情同意。

二、儀器與主要試劑

1.儀器：UltiMate3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Easy1200超高壓納升級液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，高pH值反相色譜柱C181.7 μm，100 mm×4.6 mm(美國Phenomenex公司)，納升級分析柱Acclaim PepMap C181.9 μm，75 μm×250 mm(美國Dionex公司)。

2.主要試劑：尿素(美國Gibco BRL公司)，二硫素糖醇(美國Sigma-Aldrich公司)，碘乙酰胺(美國Sigma-Aldrich公司)，甲酸(美國Thermo Fisher Scientific公司)，乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)，三乙基碳酸氫銨(美國Santa Cruz公司)，測序級胰蛋白酶(美國Promega公司)，三氟乙酸(美國Sigma-Aldrich公司)，碳酸氫銨(美國Sigma-Aldrich公司)，8標(biāo)iTRAQ試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，Top12高豐度蛋白去除試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

三、樣品處理

采用8標(biāo)iTRAQ試劑對患者血漿樣品進(jìn)行標(biāo)記，將每組的樣品分別按隨機(jī)數(shù)字表排列，依次每4例血漿樣品混為1個(gè)樣品進(jìn)行檢測，最終每組各得到4個(gè)混合樣品。使用Top12高豐度蛋白去除試劑盒對血漿樣品中的高豐度蛋白進(jìn)行去除后，加入1.5 μg胰蛋白酶于37 ℃酶切12 h，對酶切后的樣品真空冷凍干燥以備后續(xù)使用。

用100 μl超純水溶解干燥的樣品。采用8標(biāo)iTRAQ試劑在室溫條件下與樣品反應(yīng)2 h，對肽段進(jìn)行標(biāo)記。待反應(yīng)終止，將標(biāo)記后的肽段樣品加入除鹽柱內(nèi)除鹽，收集洗脫溶液并冷凍干燥備用。

四、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測

使用100 μl 10 mmol/L的碳酸氫銨水溶液溶解標(biāo)記肽段，采用UltiMate3000型高效液相色譜儀和Easy1200超高壓納升級液相色譜儀進(jìn)行分離。經(jīng)液相色譜分離后的標(biāo)記肽段采用Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，在正離子模式下采集信號，一級掃描范圍為350～1600 m/z。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Proteome Discoverer 1.4軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Mascot 2.3軟件進(jìn)行搜庫，數(shù)據(jù)庫為Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫。以DM-PTB組對DM組蛋白表達(dá)量變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.2或<0.83且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)蛋白。采用RStudio 1.2軟件對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體(Gene Ontology, GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析，采用火山圖和層次聚類熱圖對差異蛋白表達(dá)情況進(jìn)行可視化，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注 DM-PTB：糖尿病并發(fā)肺結(jié)核；DM：糖尿病圖2 糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者與糖尿病患者差異表達(dá)蛋白層次聚類熱圖

結(jié) 果

一、基本信息

DM-PTB組和DM組的年齡、性別分布、糖尿病病程、空腹血糖及胰島素使用情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM-PTB組體質(zhì)量指數(shù)明顯低于DM組，口服降糖藥者的比例明顯低于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 不同特征在DM-PTB組和DM組研究對象中的分布情況

二、DM-PTB患者血漿差異表達(dá)蛋白鑒定

在兩組研究對象中共檢測到902個(gè)蛋白，篩選出DM-PTB組對DM組的差異表達(dá)蛋白有275個(gè)，其中在DM-PTB組中表達(dá)上調(diào)的蛋白有111個(gè)，在DM-PTB組中表達(dá)下調(diào)的蛋白有164個(gè)。采用火山圖對差異蛋白的篩選結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖1；采用層次聚類熱圖對差異蛋白的表達(dá)量及樣品的聚類情況進(jìn)行可視化(圖2)，可見差異蛋白呈明顯聚類趨勢，DM-PTB組和DM組的樣品具有明顯的分組現(xiàn)象，說明各組內(nèi)樣品一致性較好。

圖1 糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者與糖尿病患者差異表達(dá)蛋白篩選結(jié)果火山圖

在篩選出的275個(gè)差異表達(dá)蛋白中，進(jìn)一步列出變化最為顯著的前20個(gè)蛋白，如表2所示，其中，在DM-PTB組患者血漿中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)最明顯的蛋白分別是C反應(yīng)蛋白和胸腺素β4。

表2 20個(gè)糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者與糖尿病患者顯著差異表達(dá)蛋白

續(xù)表2

三、差異表達(dá)蛋白的功能注釋

GO分析從細(xì)胞組成、分子功能和生物過程等3個(gè)方面對蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋，進(jìn)一步解釋差異蛋白的生物學(xué)功能。GO分析表明，275個(gè)差異表達(dá)蛋白分別富集了178條細(xì)胞組成術(shù)語、76條分子功能術(shù)語和865條生物過程術(shù)語(FDR<0.05)，其中，富集蛋白數(shù)目最多的前10條術(shù)語如表3所示。細(xì)胞組成中富集差異蛋白數(shù)目最多的是細(xì)胞器(87.27%，240/275)，此外差異蛋白還定位于細(xì)胞內(nèi)(83.27%，229/275)、膜結(jié)合細(xì)胞器(83.27%，229/275)、細(xì)胞內(nèi)組分(82.91%，228/275)和細(xì)胞質(zhì)(81.45%，224/275)等部位。分子功能中富集差異蛋白數(shù)目最多的是結(jié)合(90.55%，249/275)，此外差異蛋白還具有蛋白結(jié)合(90.36%，225/249)、負(fù)離子結(jié)合(27.31%，68/249)、蛋白復(fù)合體結(jié)合(25.70%，64/249)和同一蛋白結(jié)合(25.30%，63/249)等功能。生物過程中富集差異蛋白數(shù)目最多的是細(xì)胞過程(92.00%，253/275)，此外差異表達(dá)蛋白還參與生物調(diào)節(jié)(80.73%，222/275)、生物過程調(diào)節(jié)(78.55%，216/275)、刺激反應(yīng)(77.09%，212/275)和細(xì)胞過程調(diào)節(jié)(75.64%，208/275)等生物過程。

表3 差異表達(dá)蛋白的GO分析

四、差異蛋白的代謝通路分析

為了深入探索差異蛋白參與的代謝通路，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對上述差異蛋白進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明，275個(gè)差異表達(dá)蛋白共富集到46條代謝通路，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路有26條(FDR<0.05)，如表4所示。差異表達(dá)蛋白富集數(shù)目最多的通路為黏著斑通路(22個(gè)蛋白)。此外，差異蛋白還參與PI3K-Akt信號通路(17個(gè)蛋白)、血小板激活通路(14個(gè)蛋白)、吞噬體通路(11個(gè)蛋白)、膽固醇代謝通路(9個(gè)蛋白)和補(bǔ)體及凝血通路(8個(gè)蛋白)等與糖脂代謝和免疫相關(guān)的通路。

表4 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路分析

討 論

DM-PTB的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，除感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)外，還與免疫、遺傳和代謝等多種因素有關(guān)[12-14]，因此，有必要采用系統(tǒng)生物學(xué)方法進(jìn)行研究。Zhang等[15]比較了DM-PTB和PTB患者的血漿蛋白質(zhì)表達(dá)差異，證實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)在探索DM-PTB機(jī)制方面具有廣泛的應(yīng)用潛力；然而，該研究的設(shè)計(jì)與本研究正好相反，且選用方法的檢測能力較低。為此，筆者采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對DM-PTB和DM患者的血漿進(jìn)行研究，共篩選出275個(gè)差異表達(dá)的蛋白，為后續(xù)探討DM-PTB發(fā)病機(jī)制及早期診斷PTB提供依據(jù)。

年齡、性別及糖尿病病程與DM-PTB的發(fā)病密切相關(guān)[16]，因此，在人群招募時(shí)筆者對上述因素進(jìn)行匹配，排除了混雜因素對結(jié)果的影響。兩組患者在降糖藥使用方面存在差異，可能是由于單純使用胰島素的DM患者血糖控制較差，易成為DM-PTB患者[17]，但兩組患者的空腹血糖水平相似，說明兩組患者是具有可比性的。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)DM-PTB組患者的體質(zhì)量指數(shù)低于DM組，推測原因是PTB作為一種消耗性疾病，易造成患者營養(yǎng)不良，從而引起能量的明顯缺乏[18]。

在筆者篩選出的顯著差異表達(dá)蛋白中，急性期蛋白如C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A2、α1酸性糖蛋白1、纖維蛋白原和甘露糖結(jié)合凝集素等在DM-PTB 組表達(dá)明顯上調(diào)，該類蛋白通常無明顯的組織特異性，在機(jī)體發(fā)生感染和炎癥時(shí)呈上升趨勢。富亮氨酸α-2糖蛋白1可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β通路參與炎癥過程，Garay-Baquero等[19]發(fā)現(xiàn)PTB患者血漿中富亮氨酸α-2糖蛋白1表達(dá)水平明顯高于健康對照組，提示該蛋白可能在PTB發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DM-PTB患者血漿內(nèi)上述參與炎癥過程的蛋白均明顯增高，說明與DM患者相比，DM-PTB患者體內(nèi)的炎癥狀態(tài)明顯加重。胸腺肽β4是由胸腺組織分泌的具有生理活性的多肽，Kang等[20]發(fā)現(xiàn)PTB患者肺部肉芽腫組織內(nèi)胸腺肽β4高表達(dá)，且該蛋白與低氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)的炎癥和血管再生有關(guān)。筆者研究發(fā)現(xiàn)，DM-PTB患者血漿中胸腺肽β4下調(diào)，可能與其被募集到肺部組織內(nèi)有關(guān)。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白1和β-parvin等與細(xì)胞自噬和結(jié)構(gòu)變化有關(guān)的蛋白發(fā)生改變，這與MTB感染機(jī)體后引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過程相適應(yīng)。除上述蛋白外，筆者還發(fā)現(xiàn)了α/β水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白14B、ATP結(jié)合盒式亞族B成員9、神經(jīng)顆粒素和轉(zhuǎn)凝蛋白2等差異蛋白。既往研究表明，這些蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和多種癌癥相關(guān)[21-24]，但對于其與DM-PTB的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

本研究通過GO分析對差異蛋白進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞器的差異蛋白富集度最高。細(xì)胞器可合成并分泌多種蛋白質(zhì)，參與多項(xiàng)細(xì)胞功能。在細(xì)胞內(nèi)的眾多細(xì)胞器中，溶酶體與細(xì)胞自噬、機(jī)體免疫防御和病原體清除密切相關(guān)，可通過與吞噬小體結(jié)合形成吞噬溶酶體，進(jìn)一步殺死和降解病原體。MTB在侵襲巨噬細(xì)胞后，可抑制細(xì)胞內(nèi)吞噬小體成熟或干擾吞噬溶酶體的形成，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞自噬，促進(jìn)MTB在胞內(nèi)存活的作用[25]。此外，筆者發(fā)現(xiàn)差異蛋白的分子功能與其參與的生物學(xué)過程相適應(yīng)，主要通過結(jié)合的方式，參與包括細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)和刺激反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學(xué)過程，提示上述生物學(xué)過程可能在DM-PTB發(fā)展過程中起著重要作用。

本研究對差異蛋白進(jìn)行KEGG代謝通路分析后發(fā)現(xiàn)，黏著斑信號通路富集到的蛋白數(shù)目最多，提示該通路可能與DM-PTB發(fā)病密切相關(guān)。MTB感染機(jī)體后主要引起細(xì)胞免疫，黏著斑作為細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接的主要方式，在維持細(xì)胞運(yùn)動(dòng)張力、促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞生存信號傳遞方面發(fā)揮重要作用[26]。既往研究表明，DM和PTB患者體內(nèi)差異表達(dá)分子均富集到了黏著斑通路，提示該通路可能與DM和PTB的發(fā)病相關(guān)[27-28]。與此同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白還參與了PI3K-Akt信號通路、血小板激活通路、膽固醇代謝通路、吞噬體通路、補(bǔ)體及凝血通路等與糖脂代謝和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路。PI3K-Akt信號通路是黏著斑通路的下游通路之一，在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂肪代謝等方面發(fā)揮重要作用[29]。彭文光等[30]發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血T淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞的PI3K-Akt-mTOR通路各分子表達(dá)下調(diào)，提示該通路處于相對抑制狀態(tài)。由此可見，加強(qiáng)對PI3K-Akt信號通路內(nèi)相關(guān)蛋白的研究可能有助于進(jìn)一步揭示DM-PTB的發(fā)病機(jī)制。眾所周知，血小板在炎癥及免疫功能調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。Xu等[31]發(fā)現(xiàn)，DM-PTB患者的平均血小板體積高于PTB患者，但低于DM患者，提示血小板的形態(tài)變化可能與DM-PTB的發(fā)生有關(guān)。此外，DM患者免疫抑制和血脂代謝異常等狀態(tài)，增強(qiáng)了機(jī)體對MTB的易感性，進(jìn)一步促進(jìn)DM-PTB的發(fā)生發(fā)展[32]。

綜上所述，本研究從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度初步比較了DM和DM-PTB患者血漿蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，篩選出了可能與DM-PTB發(fā)病密切相關(guān)的蛋白，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DM-PTB患者體內(nèi)與細(xì)胞活動(dòng)、糖脂代謝和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路發(fā)生了顯著變化。下一步，作者將結(jié)合本研究鑒定到的蛋白和代謝通路繼續(xù)研究，深入發(fā)掘DM-PTB的發(fā)病機(jī)制，以期尋找特異性的蛋白標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對DM-PTB的早期識別和診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突