楊慶偉，王 芃，全迎萍

(1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津 300350；2.天津大學(xué) 理學(xué)院，天津 300354；3.天津大學(xué) 化學(xué)化工國家級實驗教學(xué)示范中心，天津 300354)

灰樹花(Grifolafrondosa)俗稱“舞菇”，在日本又稱“舞茸”，是食、藥兼用的真菌。灰樹花子實體肉質(zhì)柔軟，外觀層疊似菊，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，主要分布在日本北部、美國和歐洲等地區(qū)。國內(nèi)外對于灰樹花的研究主要集中在灰樹花多糖的生物活性方面[3]，尤其對抗腫瘤[4-5]和抗氧化活性[6-7]的研究成為近十年的研究熱點，還有少數(shù)研究降血脂[8]、降血糖[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]和抗病毒[11]等生物活性，近幾年灰樹花多糖對小鼠血脂、血糖與腸道菌群關(guān)系的研究受到越來越多的關(guān)注[12]。這些研究的活性物質(zhì)絕大多數(shù)都是水溶性灰樹花多糖，而水不溶性多糖需要改造才具有生物活性。如果多糖上的羥基被硫酸根基團(tuán)取代，就能夠提高多糖在水中的溶解度，也改變了多糖鏈的構(gòu)象，多糖的生物活性也得到了改進(jìn)[13-14]，比如研究硫酸酯化灰樹花多糖的抗腫瘤[15]、抗血管增生[16]的活性。肝素作為一種天然的硫酸酯化多糖具有抗凝血活性, 已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床中[17]，但是肝素也有副作用。肝素的抗凝血作用與分子結(jié)構(gòu)中的硫酸根含量和負(fù)電荷有關(guān)。近年來已經(jīng)有研究表明，經(jīng)過硫酸酯化修飾的多糖具有一定的溶血現(xiàn)象和抗凝血活性[18-19]。目前國內(nèi)外還沒有對灰樹花子實體多糖進(jìn)行抗凝血活性的研究。本文對灰樹花子實體水不溶性多糖進(jìn)行硫酸酯化，并優(yōu)化工藝條件，使其能夠達(dá)到水溶性，提高灰樹花多糖的利用率和活性，并對硫酸酯化多糖進(jìn)行抗凝血實驗研究。

1 材料

1.1 材料與試劑

灰樹花子實體(浙江慶元高山農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)商部)；氯磺酸(分析純，天津市元立化工試劑廠)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶(分析純，天津市光復(fù)化工研究所)；APTT、PT、TT試劑盒(天津威仕達(dá)公司)；凝血酶(北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司)；纖維蛋白原、肝素鈉(Sigma)。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(LGJ0.5)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)；冷凍離心機(jī)(Heraeus)；全自動血液凝固儀(CA-7000)(Sysmex)；葡聚糖凝膠(Sephadex G50)(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)；自動部分收集器(上海滬西儀器廠)。

2 方法

2.1 水不溶性多糖的提取

將灰樹花子實體粉碎過篩，加去離子水至灰樹花含量的50%，用超聲波在冰水浴下裂解10 min，然后加去離子水稀釋到5%，80℃水浴6 h，每隔30 min攪拌1次。水浴結(jié)束，將底部殘渣倒入2.5% 氫氧化鈉(NaOH)溶液中，并在4℃條件下過夜。去除底部殘渣，上清液用冰乙酸中和，所得沉淀經(jīng)過4 000 r·min-1離心，在0.05 mol·L-1的NaOH溶液中溶解，再經(jīng)過4 000 r·min-1離心，用3倍體積的95%乙醇沉淀上清液，低溫沉淀8 h，將沉淀物真空干燥，得到堿提水不溶性粗多糖GF[20]。

2.2 硫酸酯化多糖制備工藝優(yōu)化

采用改進(jìn)的氯磺酸—吡啶法[21]：無水吡啶(40 mL)置于反應(yīng)瓶中，冰鹽浴冷卻，劇烈攪拌下緩慢加氯磺酸20 mL，繼續(xù)攪拌30 min，備用。將GF(100、200、300 mg)懸浮于DMF(100 mL)中，倒入上述反應(yīng)瓶中，于40、50、60、70℃下攪拌反應(yīng)2、3、4 h，用2.5 mol·L-1NaOH中和，加入95 %的乙醇，離心分離，收集沉淀，將沉淀溶于100 mL蒸餾水中，裝入透析袋進(jìn)行透析(流水透析2 d，蒸餾水靜置透析1 d)，冷凍干燥得到硫酸酯化多糖S-GF。以硫酸酯化多糖的產(chǎn)率和硫酸基團(tuán)的取代度作為指標(biāo)，考查原料比例、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間3個因素的影響規(guī)律。

1)單因素條件篩選實驗

反應(yīng)溫度對硫酸酯化反應(yīng)結(jié)果的影響：在硫酸酯化過程中，反應(yīng)溫度為40、50、60、70℃下攪拌3 h，加入200 mg GF ，其他條件不變，得出產(chǎn)物計算產(chǎn)率：

硫酸酯化產(chǎn)率/%=(m1-m2)/m1×100%。

(式中：m1為硫酸酯化多糖S-GF的質(zhì)量，g；m2為GF的質(zhì)量，g)

2)固定溫度下的優(yōu)化實驗

在上述反應(yīng)溫度這個單因素研究的基礎(chǔ)上，將反應(yīng)溫度固定在60℃，以原料與氯磺酸不同比例和反應(yīng)時間為因素，每個因素采用3個水平，進(jìn)行2因素3水平全面優(yōu)化實驗，其他條件不變，計算產(chǎn)率和硫酸基取代度。

硫酸根含量測定方法：

氯化鋇—明膠濁度法，多糖中含有的硫酸基團(tuán)用取代度來表示，取代度表示每個單糖殘基上含有硫酸基團(tuán)的平均個數(shù)：

取代度=162×S%/(3 200-102×S%)。

(式中：S%為硫酸基團(tuán)的百分含量)

2.3 硫酸酯化多糖的純度鑒定

Sephadex G50凝膠柱層析：取1 mL濃度為10 mg·mL-1的多糖溶液，上 Sephadex G50 凝膠柱(1 cm×10 cm)，用去離子水作為洗脫液，流速為 0.25 mL·min-1，分管收集(每管 8 min)，利用苯酚—硫酸法檢測每管多糖的含量，繪制層析圖譜。

2.4 抗凝血實驗

所有凝血實驗均使用自動凝血儀測量。利用0.9%的氯化鈉溶液配制不同濃度的S-GF(0、20、40、80 μg·mL-1)待測樣品和肝素鈉(2 μg·mL-1)對照樣品。APTT、TT、PT凝血時間的測定方法和流程如圖1所示[22]。

圖1 APTT、TT、PT測試流程圖Fig.1 APTT、TT、PT Test Flow Chart

2.5 溶栓實驗

纖維蛋白原是凝血過程中的一種蛋白質(zhì)，是主要的凝血因子。溶栓活性采用纖維蛋白板法測定。首先分別將10 mL 0.25%(w/v)纖維蛋白原溶液、0.5 mL(60 U·mL-1)凝血酶溶液和5 mL 1%瓊脂分別加于平板上，快速搖勻，放置30 min。然后在纖維蛋白板上鉆2個小孔，取30 μL 濃度為0和200 μg·mL-1的硫酸酯化多糖S-GF生理鹽水(0.9%)溶液，加入2孔中，37℃孵育8 h。

3 結(jié)果與分析

3.1 硫酸酯化工藝條件的確定

單因素條件篩選實驗：由圖2可知，反應(yīng)溫度對酯化產(chǎn)物的得率影響顯著。在60℃以下，硫酸酯化的產(chǎn)率隨反應(yīng)溫度的升高而增大，60℃時產(chǎn)率最高，大于60℃時產(chǎn)率逐漸下降，可能由于多糖在高溫的酸性環(huán)境下發(fā)生了降解，因此確定硫酸酯化工藝中的最佳反應(yīng)溫度為60℃。

圖2 反應(yīng)溫度對硫酸酯化產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of Reaction Temperature on Sulfate Yields

固定溫度優(yōu)化實驗條件：由表1可知，其他條件不變，產(chǎn)率和取代度都會隨反應(yīng)時間的增加而增加，但是在3 h以后，反應(yīng)產(chǎn)率的增加很有限，所以考慮時間成本，確定最優(yōu)反應(yīng)時間為3 h。在反應(yīng)時間相同時，GF(mg)：氯磺酸(mL)越小，反應(yīng)產(chǎn)率和取代度越高，但是低于10∶1時，產(chǎn)率和取代度增加不明顯，從節(jié)約成本的角度確定最優(yōu)GF(mg)∶氯磺酸(mL)為10∶1。最終確定在GF∶氯磺酸=200 mg∶20 mL時，60℃下反應(yīng)3 h的條件為硫酸酯化工藝的最佳條件，得到硫酸酯化多糖S-GF的含硫量為17.5%，硫酸基取代度為2.01。

表1 不同條件對GF硫酸酯化的影響Table 1 Effects of Different Conditions on GF Sulfation

*0.01

3.2 S-GF純度鑒定結(jié)果

經(jīng)過 Sephadex G50 凝膠柱層析分析結(jié)果(圖3)，可以看到只有一個單一的洗脫峰，說明S-GF為均一組分。

圖3 S-GF的Sephadex G50層析圖譜Fig.3 Sephadex G50 Chromatogram of S-GF

3.3 S-GF抗凝血活性

采用APTT、PT、TT法對不同濃度硫酸多糖(S-GF)的抗凝活性進(jìn)行評價。體外實驗結(jié)果如圖4所示，相對空白樣品(0 μg·mL-1)，不同濃度的S-GF均能有效延長APTT和TT，并且隨著濃度的增大，APTT和TT延長的時間越長，而PT凝血時間沒有大的變化。APTT作為內(nèi)源性凝血途徑的過篩實驗，TT作為血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過篩實驗，PT作為外源性凝血途徑的過篩實驗。因此，S-GF的抗凝血機(jī)制是通過內(nèi)源性凝血途徑來完成的，而不是通過外源性凝血途徑。肝素鈉(2 μg·mL-1)的APTT比S-GF(20 μg·mL-1)的時間長，PT明顯比S-GF時間長，雖然TT比S-GF時間短，但是考慮到肝素鈉的濃度低于待測樣品的1/10，說明S-GF的抗凝血活性比肝素鈉低。

4 結(jié)論

灰樹花子實體經(jīng)過醇沉、堿提得到水不溶性多糖組分GF，對硫酸酯化工藝中的反應(yīng)溫度、時間、原料比例條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定硫酸酯化溫度為60℃、時間3 h。GF：氯磺酸=200 mg:20 mL為最佳工藝條件,得到的硫酸酯化多糖S-GF的取代度為2.01。經(jīng)過Sephadex G50柱層析證明S-GF為均一組分。通過對S-GF的活性部分進(jìn)行 APTT、TT和PT測試，證明S-GF通過內(nèi)源性凝血途徑達(dá)到抗凝血作用，并且S-GF的抗凝血活性比肝素鈉低。本文旨在能夠?qū)⒒覙浠ㄗ訉嶓w多糖進(jìn)行最大化利用，并應(yīng)用到藥物或保健品中。