柴生樾，王 浩，王西平

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100)

隨著葡萄(VitisviniferaL.)在世界范圍內(nèi)的栽培面積越來越廣，其果實(shí)品質(zhì)口感及經(jīng)濟(jì)價(jià)值成為了我們更加關(guān)注的話題。當(dāng)今時(shí)代生物信息學(xué)和分子生物學(xué)迅速發(fā)展，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)快速提高葡萄的內(nèi)在及外在品質(zhì)，培育葡萄優(yōu)良品種具有很大的意義及應(yīng)用價(jià)值。SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合蛋白近年來受到了越來越多的關(guān)注，它是SBP基因編碼的一種植物特異性的轉(zhuǎn)錄因子，包含一個(gè)大約76個(gè)氨基酸大小的SBP保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)，在蛋白與DNA結(jié)合的過程中起著重要的作用[1～3]。SBP-box基因最早是在金魚草(Antirrhinummajus)的花序中被分離的，研究發(fā)現(xiàn)它通過調(diào)節(jié)MADS-box基因而結(jié)合在SQUAMOSA的啟動(dòng)子上，從而控制早期花的發(fā)育[3]。之后，擬南芥(Arabidposisthaliana)[4]，單細(xì)胞藻類衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)[5]，水稻(Oryzasativa)[6]，小立碗蘚(Physcomitrellapatens)[7]，玉米(Zeamays)[8]和葡萄(Vitisvinifera)[9]中的SBP-box基因相繼被發(fā)掘出來。大豆中SBP-box基因成員數(shù)量最多，有111個(gè)[10～11]，蘋果中有SBP-box基因數(shù)量有42個(gè)[2]。而在擬南芥中有30個(gè)SBP-box基因，如AtSPL3可以調(diào)節(jié)擬南芥的芽發(fā)育[12]，水稻中29個(gè)SBP-box基因，如水稻的OsSPL16是粒度、形狀和品質(zhì)的調(diào)節(jié)劑[13～14]。

根據(jù)對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SBP-box基因的植物進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)，SBP-box基因在增強(qiáng)植物生物及非生物脅迫抗性方面起著重要的作用。銅是有氧生物中必須的金屬元素之一，故其代謝受到生命體嚴(yán)格的控制。銅信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控位點(diǎn)CRR1(銅響應(yīng)調(diào)節(jié)劑)有一個(gè)名為SBP的植物特異性DNA結(jié)合域，是激活和抑制衣藻中銅和低氧傳感途徑的靶基因所必需的。研究表明具有SBP結(jié)構(gòu)域的家族成員AtSPL7激活了參與銅的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，包括miR398，一些銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和CCH，是擬南芥中銅穩(wěn)態(tài)的中央調(diào)節(jié)劑[15]。擬南芥AtSPL14參與對(duì)伏馬毒素B1的敏感性而控制細(xì)胞凋亡[16]。此外SBP基因調(diào)控植物生長(zhǎng)及發(fā)育[17]，包括植物葉、花、果實(shí)形成等方面。研究發(fā)現(xiàn)SBP基因參與植物葉的形態(tài)建成并且是葉原基形成間隔期調(diào)控的基因[18]。另外SBP基因在植物花的形成及發(fā)育[19～20]方面也起著重要作用，可能促進(jìn)了植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)間的轉(zhuǎn)換[21]并且影響著果實(shí)的發(fā)育與成熟[22～23]，此外還涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]等諸多方面。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及葡萄基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的完成，已經(jīng)在葡萄中發(fā)現(xiàn)了18個(gè)SBP基因家族成員[9]。但在葡萄中對(duì)SBP-box基因的功能研究卻鮮有報(bào)道。我們初步推測(cè)，葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子與已知的其他植物功能相似，可能在抗非生物脅迫方面、植物體生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)成熟方面起著重要作用。筆者實(shí)驗(yàn)室前期通過在擬南芥中過表達(dá)VpSBP16基因并進(jìn)行干旱脅迫及高鹽處理，結(jié)果表明在擬南芥中過量表達(dá)VpSBP16可能通過調(diào)節(jié)SOS信號(hào)和ROS信號(hào)來增加幼苗和成熟植株對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性[25]。為了更深入的研究SBP基因家族，揭示該基因家族的生物學(xué)功能及分子調(diào)控機(jī)制，筆者研究對(duì)VpSBP16基因進(jìn)行原核表達(dá)，通過制備VpSBP16基因抗血清并對(duì)葡萄不同組織進(jìn)行蛋白表達(dá)，這有利于對(duì)葡萄SBP基因家族進(jìn)行更加全面的了解和分析，為進(jìn)一步研究該基因家族提供了更有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的葉片、花序、莖、卷須以及不同時(shí)期的果實(shí)均采自種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃的華東葡萄(V.pseudoreticulata)‘白河-35-1’及毛葡萄(V.quinquangularis)‘商-24’；新西蘭雄性大白兔購(gòu)于西北農(nóng)林科技大學(xué)種兔場(chǎng)；大腸桿菌菌株Escherichia.ColiDH5α、Rosetta(DE3)、原核表達(dá)載體pGEX-6p-1均由西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；DNA聚合酶、DNA、蛋白質(zhì)Marker、限制性核酸內(nèi)切酶、均購(gòu)自大連TaKaRa公司；連接試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒由北京天根公司提供；增強(qiáng)型HRP-DAB底物染色試劑盒與抗GST鼠源單克隆抗體分別購(gòu)于北京天根公司和南京金斯瑞公司。弗氏完全和不完全佐劑、CAPS、氨芐青霉素、牛血清蛋白、IPTG為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體分別購(gòu)自為美國(guó)ABGENT公司和美國(guó)JACKSON公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子VpSBP16在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化及融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將構(gòu)建好的T-Easy-VpSBP16與pGEX-6p-1載體用BamHI、XhoI雙酶切后，回收產(chǎn)物過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定測(cè)序結(jié)果正確后，提取pGEX-VpSBP16重組質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切檢測(cè)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rosetta(DE3)，轉(zhuǎn)化方法為熱激法，轉(zhuǎn)化完成后涂布于含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板中，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)16 h，菌液活化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)條帶位置是否正確。在超凈工作臺(tái)中，將5μL鑒定正確的菌液接種于30 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)至OD600約為0.4～0.6，再次按1∶100(V/V)的比例吸取菌液加入到新的100 mL LB液體培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.6時(shí)加入IPTG，用分光光度計(jì)測(cè)量此溶液終濃度達(dá)到0.6 mmol/L，于27℃培養(yǎng)箱誘導(dǎo)培養(yǎng)重組蛋白8 h；取誘導(dǎo)液1 mL，12 000 rmp/min離心1 min，沉淀中加入200 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，在開水中煮沸10 min，室溫下12 000 rmp/min離心3 min后吸取20 μL上清溶液上樣，電泳檢測(cè)后用考馬斯亮藍(lán)染液染色2 h后，加入適量的脫色液脫色對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化分析。

1.2.2 GST-VpSBP16融合蛋白可溶性分析及純化 取50 mL誘導(dǎo)菌液離心收集菌體，將離心管中的沉淀重懸于5 mL PBS緩沖液中，誘導(dǎo)菌液放置于冰上，超聲波破碎約15 min至菌液粘稠透亮，將全部的細(xì)胞裂解物4℃下，9 000 rpm離心5 min分離菌體，將菌液上清吸取到2 mL離心管中，沉淀溶解于PBS緩沖液中充分震蕩溶解。分別取等量上清與沉淀的溶解液，加入等體積上樣緩沖液，通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)可溶性和不溶性部分的蛋白含量；以轉(zhuǎn)化空載體的重組菌和未添加IPTG誘導(dǎo)的陽性重組菌為陰性對(duì)照。

為了純化重組蛋白，再次將重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后并用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。我們使用電透析，切膠的方式純化蛋白，為便于切割必須使目的融合蛋白清晰可見，電泳結(jié)束后首先用考馬斯亮藍(lán)染色液染色10 min，再將配置好的KCl溶液置于冰上，再次染色直到背景清晰，用手術(shù)刀快速精確的將蛋白條帶切于透析袋中。將少量Tris-Glycine緩沖液裝入透析袋放置在水平電泳槽中，90V水平電泳3 h，反向電泳30 min。電泳結(jié)束后，取50 mL溶液液氮速凍，-80℃冰箱靜置4 h，于冷凍凍干機(jī)凍干48 h。待純化后的蛋白質(zhì)充分凍干后，將粉末溶解于PBS緩沖液中，測(cè)定蛋白質(zhì)溶液濃度后，通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)是否被純化。純化的蛋白溶液可存放在4℃冰箱內(nèi)在一周內(nèi)使用，或者在-80℃冰箱中冷凍保存。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子VpSBP16抗血清的制備與Western blot檢測(cè) 用PBS緩沖液將保存的純化蛋白稀釋至1 500 mg/mL，取1.5 mL純化蛋白溶液與等體積的完全弗氏佐劑混勻，充分乳化后作為注射所用的抗原。免疫接種選用新西蘭大白兔，每隔10 d進(jìn)行皮下注射，注射位點(diǎn)選用背部或腹股溝，每次注射400 g，共注射3次。第一次免疫后完全弗氏佐劑換為不完全弗氏佐劑，最后一次免疫7 d后心臟穿刺取血，常規(guī)方法獲得抗血清，將獲得的抗血清4℃儲(chǔ)存。

根據(jù)美國(guó)伯樂半干轉(zhuǎn)儀的說明，轉(zhuǎn)膜時(shí)轉(zhuǎn)膜儀上依次為厚濾紙-PVDF膜-膠-厚濾紙，轉(zhuǎn)膜成功后在搖床上封閉3 h，倒掉封閉液，加入TBST緩沖液，并將所制備的抗血清按1∶20、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105倍稀釋作為一抗，一抗孵育完畢后，倒掉溶液，用TBST緩沖液洗脫，再用HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，倒掉溶液，用TBST緩沖液沖洗三次后按照HRP-DAB底物顯色試劑盒說明進(jìn)行顯色。

1.2.4 葡萄不同組織總蛋白的提取及VpSBP16蛋白的表達(dá)分析 將新鮮的葡萄組織加入液氮預(yù)冷的研缽中充分研磨，研磨完成后利用Tris-丙酮-酚法[26]提取葡萄不同組織及果實(shí)不同時(shí)期中的全蛋白，并在95℃加熱5 min，使用含5%的濃縮膠10 mL，10%的分離膠15 mL，以‘商-24’葡萄的葉、莖、花序、卷須4種組織及果實(shí)發(fā)育中的6個(gè)時(shí)期的蛋白為樣品，每個(gè)樣品上樣量為30μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，一抗添加3 μL的VpSBP16抗血清，Western blot與轉(zhuǎn)印方法同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子VpSBP16在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化及融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGEX-VpSBP16進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得了如圖1所示的約1 674 bp的目標(biāo)片段，序列比對(duì)結(jié)果正確。重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中后，將陽性重組菌及對(duì)照菌于搖床培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，于0.6 mmol/L的IPTG，27℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。電泳結(jié)果(圖2)表明，IPTG誘導(dǎo)的陽性重組菌高表達(dá)出約87 kD的特異條帶(黑色箭頭)，與預(yù)期大小基本一致。與陰性對(duì)照對(duì)比可知，轉(zhuǎn)化空載體的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后則表達(dá)出分子量為26 kD的條帶。這個(gè)條帶的大小與GST標(biāo)簽蛋白大小一致，充分證明了華東葡萄轉(zhuǎn)錄因子VpSBP16蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖2 pGEX-VpSBP16在Rosetta(DE3)菌株中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

2.2 GST-VpSBP16融合蛋白可溶性分析及純化

SDS-PAGE電泳檢測(cè)離心后收集的上清與沉淀，結(jié)果表明沉淀中融合蛋白表達(dá)量明顯比上清中要高(圖3，泳道5)，而在上清中目的蛋白的表達(dá)非常微弱(圖3，泳道4)，這表明目的融合蛋白主要存在于在沉淀中，并且GST-VpSBP16融合蛋白的主要表達(dá)形式為包涵體。通過電透析法，切膠回收法將目的融合蛋白從凝膠中分離經(jīng)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)GST-VpSBP16融合蛋白已經(jīng)得到較好的純化(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)錄因子VpSPB16原核表達(dá)蛋白的可溶性分析

圖4 GST-VpSBP16融合蛋白純化產(chǎn)物的電泳分析

2.3 轉(zhuǎn)錄因子VpSBP16抗血清的制備與Western blot檢測(cè)

抗原選用純化后的GST-VpSBP16融合蛋白注射新西蘭大白兔產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且產(chǎn)生抗體，從而獲得VpSBP16基因多克隆抗血清。從圖5顯示的結(jié)果可以看出，當(dāng)用不同稀釋倍數(shù)的抗血清進(jìn)行Western blot分析時(shí)，均可以產(chǎn)生87KD，清晰且單一的雜交信號(hào)，這個(gè)結(jié)果充分表明以純化蛋白包涵體形式所制備的抗血清可特異性地與抗原產(chǎn)生反應(yīng)，而且泳道7的結(jié)果顯示在稀釋比例達(dá)到1：105時(shí)依然能夠明顯的檢測(cè)到單一的蛋白條帶。陽性對(duì)照在檢測(cè)目的融合蛋白時(shí)以GST鼠源單抗進(jìn)行孵育，陰性對(duì)照選用pGEX-6p-1空載經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物并且用目的蛋白抗血清進(jìn)行孵育。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子VpSBP16多克隆抗血清的Western blot分析

2.4 VpSBP16基因在葡萄不同組織中的Western blot檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所得抗體是否可以檢測(cè)到葡萄中的VpSBP16基因表達(dá)蛋白，我們提取了毛葡萄‘商24’中5個(gè)不同組織的總蛋白，利用Western blot檢測(cè)葡萄花，果實(shí)，莖，卷須，葉中的VpSBP16蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中制備的抗體可以特異性的與‘商24’中的VpSBP16表達(dá)蛋白結(jié)合，并在染色后顯示出清晰的蛋白條帶。不僅如此，我們還觀察到在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期卷須中的VpSBP16蛋白表達(dá)含量最高而花序中的VpSBP16蛋白表達(dá)含量最低，在葡萄果實(shí)發(fā)育時(shí)期的綠果期相較于花后45～100 dVpSBP16蛋白表達(dá)含量偏高。(如圖6)。

圖6 毛葡萄‘商-24’不同組織中VpSBP16蛋白的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VpSBP16轉(zhuǎn)化菌株后，在27℃培養(yǎng)的條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h可以使融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)，純化后的蛋白通過免疫新西蘭大白兔制備抗血清。結(jié)果表明我們獲得了純化的目的融合蛋白GST-VpSBP16，還制備了效價(jià)高達(dá)105的特異性抗血清。研究表明重組菌能否被成功誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物的多少及存在形式是制備抗體的重要環(huán)節(jié)，故表達(dá)載體、菌株選擇、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物IPTG濃度都是實(shí)驗(yàn)中需要考慮的重要因素[27]。研究選用pGEX-6p-1載體是由于該載體上含有一段GST標(biāo)簽，使得融合蛋白的產(chǎn)量和可溶性得到提高，其次便于檢測(cè)和純化目的融合蛋白。Rosetta(DE3)菌株具有眾所周知的遺傳背景，并包含對(duì)氯霉素具有抗性的質(zhì)粒[28]有利于外源基因在大腸桿菌內(nèi)的順利表達(dá)。采用27℃過夜誘導(dǎo)的表達(dá)條件，是因?yàn)樵?2～37℃的范圍之內(nèi)降低誘導(dǎo)溫度可提高可溶性蛋白的含量[29]。根據(jù)前人研究經(jīng)驗(yàn)，宿主細(xì)菌蛋白酶隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)的降解作用增加，所以達(dá)到蛋白表達(dá)最大量后蛋白增加將不明顯[30]，故筆者實(shí)驗(yàn)采用IPTG濃度為0.6 mmol/L，8 h過表達(dá)目標(biāo)融合蛋白，根據(jù)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示該條件足以滿足后期蛋白質(zhì)回收，純化和抗原制備的要求。由于包涵體蛋白復(fù)性會(huì)造成二硫鍵錯(cuò)配使蛋白質(zhì)失活[30]，所以研究采用切膠，電透析的方式獲得高效價(jià)的純化蛋白。

SBP轉(zhuǎn)錄因子家族具有一個(gè)共同的脫氧核糖核酸結(jié)合域(SBP域)和一個(gè)不同尋常的鋅指結(jié)構(gòu)，這一類轉(zhuǎn)錄因子中的許多基因被認(rèn)為在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗非生物脅迫中起著重要的作用[9]。筆者實(shí)驗(yàn)室前期在擬南芥上過表達(dá)VpSBP16基因發(fā)現(xiàn)該基因可以提高擬南芥對(duì)干旱及高鹽脅迫的抗性。為深入探索VpSBP16的功能，筆者試驗(yàn)制備VpSBP16多克隆抗血清并運(yùn)用Western blot技術(shù)對(duì)毛葡萄果實(shí)，花序，莖，葉，卷須等不同器官的目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示VpSBP16多克隆抗血清可以與目的基因蛋白雜交出特異性的條帶，這表明我們所制備的多克隆抗血清可以運(yùn)用于后續(xù)VpSBP16功能研究試驗(yàn)。通過觀察VpSBP16蛋白表達(dá)條帶發(fā)現(xiàn)花序的蛋白表達(dá)量偏低，而花后15～30 d的綠果期含量偏高，這與之前報(bào)道的SBP-box基因家族影響果實(shí)發(fā)育和成熟的結(jié)論一致[22]，可能暗示著VpSBP16轉(zhuǎn)錄因子同樣也參與葡萄果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)制，且在葡萄從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要作用。此外，在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，卷須中的VpSBP16蛋白表達(dá)含量最高可能暗示著VpSBP16轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控葡萄卷須的生長(zhǎng)發(fā)育，具體調(diào)控機(jī)理需進(jìn)一步深入研究。

總之，我們獲得了具有生物活性的重組蛋白，制備了VpSBP16基因的多克隆抗血清，它能夠特異的識(shí)別天然的VpSBP16表達(dá)蛋白，在蛋白水平上利用此抗血清對(duì)毛葡萄中VpSBP16基因功能進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，為下一步開展VpSBP16基因功能的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)，為研究葡萄SBP家族的分子機(jī)制及蛋白功能提供了依據(jù)。